Utilisation de données à un seul ver pour quantifier l’hétérogénéité dans les interactions caenorhabditis elegans-bactériennes
Summary
Ce protocole décrit une perturbation de 96 puits de Caenorhabditis elegans colonisés par des bactéries individuelles à la suite d’une paralysie par le froid et d’un blanchiment de surface pour éliminer les bactéries externes. La suspension résultante est plaquée sur des plaques de gélose pour permettre une quantification précise et à débit moyen de la charge bactérienne dans un grand nombre de vers individuels.
Abstract
Le nématode Caenorhabditis elegans est un système modèle pour les interactions hôte-microbe et hôte-microbiome. À ce jour, de nombreuses études utilisent des digestes par lots plutôt que des échantillons individuels de vers pour quantifier la charge bactérienne dans cet organisme. Ici, il est soutenu que la grande variabilité interindividuelle observée dans la colonisation bactérienne de l’intestin de C. elegans est informative et que les méthodes de digestion par lots rejettent les informations importantes pour une comparaison précise entre les conditions. Comme la description de la variation inhérente à ces échantillons nécessite un grand nombre d’individus, un protocole pratique de plaque de 96 puits pour la perturbation et le placage des colonies de vers individuels est établi.
Introduction
L’hétérogénéité des associations hôte-microbe est observée partout, et la variation entre les individus est de plus en plus reconnue comme un facteur contribuant aux processus au niveau de la population, de la compétition et de la coexistence1 à la transmission de la maladie 2,3,4. Chez C. elegans, une « hétérogénéité cachée » au sein des populations isogéniques a été observée à plusieurs reprises, avec des sous-populations d’individus présentant des phénotypes distincts dans la réponse au choc thermique 5,6, le vieillissement et la durée de vie 7,8,9,10,11, et de nombreux autres aspects de la physiologie et du développement12 . La plupart des analyses qui tentent d’identifier la structure des sous-populations fournissent des preuves de deux sous-populations dans des populations expérimentales de vers isogéniques synchronisés 5,7,8, bien que d’autres données suggèrent la possibilité de distributions de caractères au sein de la population plutôt que de groupes distincts 7,12,13 . Il est pertinent ici, une hétérogénéité substantielle dans les populations intestinales est observée même au sein de populations isogéniques de vers colonisés à partir d’une source partagée de microbes 13,14,15,16, et cette hétérogénéité peut être dissimulée par les mesures de digestion par lots qui sont largement utilisées 17,18,19,20 pour la quantification bactérienne chez le ver.
Ce travail présente des données suggérant la nécessité de s’appuyer davantage sur les mesures à un seul ver dans l’association hôte-microbe, ainsi que des protocoles pour augmenter la précision et le débit dans la perturbation d’un seul ver. Ces protocoles sont conçus pour faciliter la perturbation mécanique d’un grand nombre de C. elegans individuels pour la quantification de la charge bactérienne viable, tout en offrant une meilleure répétabilité et un effort par échantillon inférieur à celui des vers individuels à base de pilon. Une étape de purge intestinale recommandée, où les vers sont autorisés à se nourrir d’E. coli tué par la chaleur avant la préparation à la perturbation, est incluse pour minimiser les contributions des bactéries récemment ingérées et d’autres bactéries transitoires (non adhérentes). Ces protocoles comprennent une méthode de paralysie à froid pour nettoyer la cuticule avec un traitement à faible concentration d’eau de Javel de surface; Le blanchiment de surface peut être utilisé comme étape préparatoire à la perturbation d’un seul ver ou comme méthode de préparation de vers vivants, externes exempts de germes. Cette méthode de blanchiment de surface est suffisante pour éliminer un large éventail de microbes externes, et le traitement par le froid offre une alternative à la paralysie conventionnelle à base de lévamisole; alors que le lévamisole sera préféré pour les expériences sensibles au froid, la paralysie par le froid minimise les contributions aux flux de déchets dangereux et permet une reprise rapide de l’activité normale. Alors que le protocole complet décrit une expérience de laboratoire où les vers sont colonisés par des bactéries connues, les procédures de nettoyage des vers et de perturbation d’un seul ver peuvent facilement être appliquées aux vers isolés à partir d’échantillons sauvages ou colonisés dans des expériences de microcosme. Les protocoles décrits ici produisent des bactéries vivantes extraites de l’intestin du ver, adaptées au placage et à la quantification des unités formant des colonies (UFC) chez les vers individuels; pour l’analyse de la communauté intestinale basée sur le séquençage, des étapes ultérieures de lyse cellulaire et d’extraction des acides nucléiques doivent être ajoutées à ces protocoles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, des données sont présentées sur les avantages de la quantification par un seul ver de la charge bactérienne chez C. elegans, ainsi que sur un protocole de perturbation de 96 puits pour permettre l’acquisition rapide et cohérente de grands ensembles de données de ce type. Par rapport aux méthodes existantes33, ces protocoles permettent une mesure à plus haut débit des communautés microbiennes intestinales dans le ver.
Cette approche a le placage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier H. Schulenberg et C. LaRock pour leur généreux partage des souches bactériennes utilisées dans ces expériences. Ce travail a été soutenu par un financement de l’Université Emory et de la NSF (PHY2014173).
Materials
| 96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| 96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
| 96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
| 96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
| Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
| BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
| Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
| Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
| Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
| Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
| Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
| Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
| Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
| Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
| Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |
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