Mave-tarmkanalen er et af de mest følsomme organer for skade ved stråleterapeutiske kræftbehandlinger. Det er samtidig et organsystem med en af de højeste regenerative kapaciteter efter sådanne fornærmelser. Den præsenterede protokol beskriver en effektiv metode til at studere tarmepithelets regenerative kapacitet.
Tarmepitelet består af et enkelt lag af celler, men indeholder flere typer terminalt differentierede celler, som genereres ved aktiv spredning af intestinale stamceller placeret i bunden af tarmkrypter. Under tilfælde af akut tarmskade gennemgår disse aktive tarmstamceller imidlertid celledød. Gammabestråling er en meget anvendt kolorektal cancerbehandling, som, selvom den er terapeutisk effektiv, har den bivirkning, at den nedbryder den aktive stamcellepulje. Faktisk oplever patienter ofte gastrointestinalt strålingssyndrom, mens de gennemgår strålebehandling, delvis på grund af aktiv stamcelleudtømning. Tabet af aktive tarmstamceller i tarmkrypter aktiverer en pulje af typisk hvilende reserve intestinale stamceller og inducerer dedifferentiering af sekretoriske og enterocytprecursorceller. Hvis ikke for disse celler, ville tarmepitelet mangle evnen til at komme sig efter strålebehandling og andre sådanne store vævsfornærmelser. Nye fremskridt inden for afstamningssporingsteknologier muliggør sporing af aktivering, differentiering og migration af celler under regenerering og er med succes blevet anvendt til at studere dette i tarmen. Denne undersøgelse har til formål at skildre en metode til analyse af celler i musens tarmepitel efter strålingsskade.
Det menneskelige tarmepitel ville dække omtrent overfladen af en halv badmintonbane, hvis den blev placeret helt fladt1. I stedet komprimeres dette enkelt cellelag, der adskiller mennesker fra indholdet af deres tarme, til en række fingerlignende fremspring, villi og fordybninger, krypter, der maksimerer tarmens overfladeareal. Cellerne i epitelet differentierer langs en krypt-villusakse. Villus består primært af næringsstofabsorberende enterocytter, slimudskillende bægerceller og de hormonproducerende enteroendokrine celler, mens krypterne primært består af defensinproducerende Paneth-celler, aktive og reservestamceller og stamceller 2,3,4,5. Desuden genererer den tovejskommunikation, disse celler har med stromale og immunceller i det underliggende mesenkymale rum og lumens mikrobiota, et komplekst netværk af interaktioner, der opretholder tarmhomeostase og er afgørende for genopretning efter skade 6,7,8.
Tarmepitelet er det hurtigst selvfornyende væv i menneskekroppen med en omsætningshastighed på 2-6 dage 9,10,11. Under homeostase deler aktive stamceller i bunden af tarmkrypter (kryptbasesøjleceller), der er kendetegnet ved ekspressionen af leucinrige gentagne holdige G-proteinkoblede receptor 5 (LGR5), hurtigt og tilvejebringer stamceller, der adskiller sig i alle andre intestinale epitellinjer. På grund af deres høje mitotiske hastighed er aktive stamceller og deres umiddelbare forfædre imidlertid særligt følsomme over for gammastrålingsskader og gennemgår apoptose efter bestråling 5,12,13,14. Efter deres tab gennemgår reservestamceller og ikke-stamceller (subpopulation af forfædre og nogle terminalt differentierede celler) i tarmkrypter aktivering og genopfylder basalkryptrummet, som derefter kan rekonstituere cellepopulationer af villi og dermed regenerere tarmepitelet15. Ved hjælp af afstamningssporingsteknikker har flere forskergrupper vist, at reservestamceller (hvilende) er i stand til at understøtte regenerering ved tab af aktive stamceller 13,16,17,18,19,20,21,22. Disse celler er karakteriseret ved tilstedeværelsen af polycomb kompleks protein 1 onkogen (Bmi1), mus telomerase revers transkriptase gen (mTert), Hop homeobox (Hopx) og leucin-rige gentage protein 1 gen (Lrig1). Derudover har det vist sig, at ikke-stamceller er i stand til at genopbygge tarmkrypter ved skade 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Det har især vist sig, at forfædre til sekretoriske celler og enterocytter gennemgår dedifferentiering ved skade, vender tilbage til stamlignende celler og understøtter regenerering af tarmepitelet. Nylige undersøgelser har identificeret celler, der udtrykker flere markører, der har kapacitet til at erhverve stammelignende egenskaber ved skade (såsom DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Overraskende viste Yu et al., at selv modne Paneth-celler (LYZ +) kan bidrage til intestinal regenerering37. Ud over at forårsage apoptose af intestinale epitelceller og forstyrre epitelbarrierefunktionen resulterer bestråling desuden i dysbiose af tarmfloraen, immuncelleaktivering og initiering af et proinflammatorisk respons samt aktivering af mesenkymale og stromale celler38,39.
Gammastråling er et værdifuldt terapeutisk værktøj i kræftbehandling, især for kolorektal tumorer40. Bestråling påvirker imidlertid signifikant intestinal homeostase ved at fremkalde skade på cellerne, hvilket fører til apoptose. Strålingseksponering forårsager flere forstyrrelser, der bremser patientens opsving og er præget af slimhindeskade og betændelse i den akutte fase og diarré, inkontinens, blødning og mavesmerter på lang sigt. Denne panoply af manifestationer kaldes gastrointestinal strålingstoksicitet. Derudover kan strålingsinduceret progression af transmural fibrose og/eller vaskulær sklerose først manifestere sig år efter behandlingen38,41. Samtidig med selve skaden inducerer stråling et reparationsrespons i tarmceller, der aktiverer signalveje, der er ansvarlige for at initiere og orkestrere regenerering42. Strålingsinduceret tyndtarmssygdom kan stamme fra bækken- eller abdominal strålebehandling, der leveres til andre organer (såsom livmoderhalsen, prostata, bugspytkirtel, endetarm)41,43,44,45,46. Tarmbestrålingsskader er således et væsentligt klinisk problem, og en bedre forståelse af den resulterende patofysiologi vil sandsynligvis fremme udviklingen af interventioner til lindring af gastrointestinale komplikationer forbundet med strålebehandling. Der er andre teknikker, der gør det muligt at undersøge det regenerative formål med tarmepitelet bortset fra stråling. Transgene og kemiske murinmodeller til undersøgelse af inflammation og regenerering derefter er blevet udviklet47. Dextran natriumsulfat (DSS) inducerer betændelse i tarmen og fører til udvikling af egenskaber svarende til inflammatoriske tarmsygdomme48. En kombination af DSS-behandling med den pro-kræftfremkaldende forbindelse azoxymethan (AOM) kan resultere i udvikling af colitis-associeret cancer48,49. Iskæmi reperfusionsinduceret skade er en anden metode, der anvendes til at studere det regenerative potentiale i tarmepitelet. Denne teknik kræver erfaring og kirurgisk viden50. Desuden forårsager ovennævnte teknikker andre typer skader end stråling og kan føre til involvering af forskellige regenereringsmekanismer. Derudover er disse modeller tidskrævende, mens strålingsteknikken er ret kort. For nylig er in vitro-metoder, der anvender enteroider og colonoider genereret fra tarm og tyktarm, blevet anvendt i kombination med strålingsskade til at studere mekanismerne for intestinal regenerering51,52. Disse teknikker rekapitulerer imidlertid ikke fuldt ud det organ, de modellerer53,54.
Den fremlagte protokol indeholder beskrivelsen af en murinmodel af gammastrålingsskade i kombination med en genetisk model, der efter tamoxifenbehandling muliggør sporing af slægter, der stammer fra reservestamcellepopulationen (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Denne model anvender en 12 Gy totalkropsbestråling, som inducerer signifikant nok tarmskade til at aktivere reservestamceller, mens den stadig giver mulighed for efterfølgende undersøgelse af tarmregenerativ kapacitet inden for 7 dage efter skade55.
Denne protokol beskriver en robust og reproducerbar strålingsskademodel. Det giver mulighed for præcis analyse af ændringerne i tarmepitelet i løbet af 7 dage efter skaden. Det er vigtigt, at de valgte tidspunkter afspejler afgørende stadier af skade og er kendetegnet ved tydelige ændringer i tarmen (skade, apoptose, regenerering og normaliseringsfaser)60. Denne bestrålingsmodel er blevet fastlagt og omhyggeligt vurderet, hvilket viser en passende manifestation af efterligningsskade som den…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at anerkende Stony Brook Cancer Center Histology Research Core for eksperthjælp med forberedelse af vævsprøver og Division of Laboratory Animal Resources ved Stony Brook University for hjælp til dyrepleje og håndtering. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health DK124342 tildelt Agnieszka B. Bialkowska og DK052230 til Dr. Vincent W. Yang.
1 mL syringe | BD | 309659 | – |
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight | VWR | 20068-630 | – |
27G x 1/2" needle | BD | 305109 | – |
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe | Covidien | 1188128012 | – |
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) | Santa Cruz Biotechnology | sc284628A | 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C |
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | – |
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson Laboratory | Strain #:006148 | |
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J | The Jackson Laboratory | Strain #:010531 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock | Millipore-Sigma | 3116956001 | |
Chicken anti-GFP | Aves | GFP-1020 | |
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen | Thermo Fisher Scientific | C10638 | – |
Corn oil | Millipore-Sigma | C8267 | – |
Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | – |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | light sensitive |
DNase-free proteinase K | Invitrogen | C10618H | diluted 25x in DPBS |
Donkey anti-chicken AF647 | Jackson ImmunoResearch | 703-605-155 | |
DPBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | – |
Eosin | Fisher Scientific | S176 | |
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X | Nikon | ||
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Millipore-Sigma | F4680-25ML | |
Gamma Cell 40 Exactor | Best Theratronics Ltd. | – | 0.759 Gy min-1 |
Goat anti-rabbit AF488 | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 | Millipore-Sigma | GHS332 | |
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific | Fisher Scientific | 23-900-668 | |
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) | Thermo Fisher Scientific | H3569 | dilution 1:1000 |
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical | Fisher Scientific | 18-603-252 | – |
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) | Millipore-Sigma | 11684795910 | |
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | L119-500 | 0.5g/1L dH2O |
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL | VWR | 89215-218 | – |
Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | – |
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade | Capitol Scientific | AAP-281000ACSCSLT | – |
Rabbit anti-Ki67 | BioCare Medical | CRM325 | |
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree | Fisher Scientific | 50-728-103 | |
Sodium Citrate Dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
Stainless Steel Dissecting Kit | VWR | 25640-002 | |
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
Tamoxifen | Millipore-Sigma | T5648 | 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive |
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle | Sakura | 4465 | |
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades | Sakura | 4689 | |
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set | Sakura | 4451 | |
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid | Sakura | 4456 | |
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid | Sakura | 4457 | |
Tween 20 | Millipore-Sigma | P7949 | |
Unisette Processing Cassettes | VWR | 87002-292 | – |
VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-081 | |
Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL |