Regeneration des Darmepithels als Reaktion auf ionisierende Bestrahlung

Summary

Der Magen-Darm-Trakt ist eines der empfindlichsten Organe für Verletzungen bei strahlentherapeutischen Krebsbehandlungen. Es ist gleichzeitig ein Organsystem mit einer der höchsten Regenerationskapazitäten nach solchen Beleidigungen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Untersuchung der Regenerationsfähigkeit des Darmepithels.

Abstract

Das Darmepithel besteht aus einer einzigen Zellschicht, enthält jedoch mehrere Arten von terminal differenzierten Zellen, die durch die aktive Proliferation von Darmstammzellen am Boden von Darmkrypten erzeugt werden. Bei einer akuten Darmschädigung kommt es jedoch zu einem Zelltod dieser aktiven Darmstammzellen. Die Gammabestrahlung ist eine weit verbreitete Behandlung von Darmkrebs, die zwar therapeutisch wirksam ist, aber den Nebeneffekt hat, dass der aktive Stammzellpool erschöpft ist. In der Tat kommt es häufig zu einem gastrointestinalen Strahlensyndrom, während sie sich einer Strahlentherapie unterziehen, was zum Teil auf einen aktiven Stammzellabbau zurückzuführen ist. Der Verlust aktiver intestinaler Stammzellen in intestinalen Krypten aktiviert einen Pool von typischerweise ruhenden intestinalen Reservestammzellen und induziert eine Dedifferenzierung von sekretorischen und enterozytenartigen Vorläuferzellen. Ohne diese Zellen wäre das Darmepithel nicht in der Lage, sich von einer Strahlentherapie und anderen schweren Gewebeverletzungen zu erholen. Neue Fortschritte in der Abstammungsverfolgung ermöglichen es, die Aktivierung, Differenzierung und Migration von Zellen während der Regeneration zu verfolgen und wurden erfolgreich eingesetzt, um dies im Darm zu untersuchen. Ziel dieser Arbeit ist es, eine Methode zur Analyse von Zellen im Darmepithel der Maus nach Strahlenschädigung darzustellen.

Introduction

Das menschliche Darmepithel würde ungefähr die Oberfläche eines halben Badmintonfeldes bedecken, wenn es vollständig flach platziert würde¹. Stattdessen wird diese einzelne Zellschicht, die den Menschen vom Inhalt seines Darms trennt, zu einer Reihe von fingerartigen Fortsätzen, Zotten und Vertiefungen, Krypten, verdichtet, die die Oberfläche des Darms maximieren. Die Zellen des Epithels differenzieren sich entlang einer Krypten-Zotten-Achse. Die Zotten bestehen hauptsächlich aus nährstoffabsorbierenden Enterozyten, schleimabsondernden Becherzellen und den hormonproduzierenden enteroendokrinen Zellen, während die Krypten hauptsächlich aus Defensin-produzierenden Paneth-Zellen, aktiven und Reserve-Stammzellen sowie Vorläuferzellen bestehen 2,3,4,5. Darüber hinaus erzeugen die bidirektionale Kommunikation dieser Zellen mit den Stroma- und Immunzellen des darunter liegenden mesenchymalen Kompartiments und der Mikrobiota des Lumens ein komplexes Netzwerk von Interaktionen, das die Darmhomöostase aufrechterhält und für die Genesung nach Verletzungen entscheidend ist ^6,7,8.

Das Darmepithel ist das sich am schnellsten selbst erneuernde Gewebe im menschlichen Körper, mit einer Umsatzrate von 2-6 Tagen 9,10,11. Während der Homöostase teilen sich aktive Stammzellen an der Basis von Darmkrypten (kryptenbasensäulenförmige Zellen), die durch die Expression des Leucin-reichen, wiederholungshaltigen G-Protein-gekoppelten Rezeptors 5 (LGR5) gekennzeichnet sind, schnell und liefern Vorläuferzellen, die sich in alle anderen intestinalen Epithellinien differenzieren. Aufgrund ihrer hohen Mitoserate reagieren aktive Stammzellen und ihre unmittelbaren Vorläuferzellen jedoch besonders empfindlich auf Schäden durch Gammastrahlung und unterliegen nach^{Bestrahlung einer} Apoptose ^5,12,13,14. Nach ihrem Verlust werden Reservestammzellen und Nicht-Stammzellen (Subpopulationen von Vorläuferzellen und einige terminal differenzierte Zellen) in Darmkrypten aktiviert und füllen das basale Kryptenkompartiment wieder auf, das dann Zellpopulationen der Zotten rekonstituieren und so das Darmepithel regenerieren kann¹⁵. Mehrere Forschungsgruppen haben gezeigt, dass Reservestammzellen (ruhende Stammzellen) in der Lage sind, die Regeneration nach dem Verlust aktiver Stammzellen zu unterstützen 13,16,17,18,19,20,21,22. Diese Zellen zeichnen sich durch das Vorhandensein des Polycomb-Komplex-Protein-1-Onkogens (Bmi1), des Maus-Telomerase-Reverse-Transkriptase-Gens (mTert), der Hopfen-Homöobox (Hopx) und des Leucin-reichen Repeat-Protein-1-Gens (Lrig1) aus. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Nicht-Stammzellen in der Lage sind, Darmkrypten bei einer Verletzung wieder aufzufüllen 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass Vorläuferzellen von sekretorischen Zellen und Enterozyten bei einer Verletzung eine Dedifferenzierung erfahren, zu stammähnlichen Zellen zurückkehren und die Regeneration des Darmepithels unterstützen. Neuere Studien haben Zellen identifiziert, die mehrere Marker exprimieren, die die Fähigkeit besitzen, bei einer Verletzung stammähnliche Eigenschaften zu erwerben (z. B. DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1⁺)^{32,33,34,35,36}. Überraschenderweise zeigten Yu et al., dass auch reife Paneth-Zellen (LYZ⁺) zur Darmregeneration beitragen können³⁷. Darüber hinaus führt die Bestrahlung nicht nur zur Apoptose von Darmepithelzellen und zur Störung der epithelialen Barrierefunktion, sondern auch zu einer Dysbiose der Darmflora, zur Aktivierung von Immunzellen und zur Initiierung einer entzündungsfördernden Reaktion sowie zur Aktivierung von mesenchymalen und stromalen Zellen^38,39.

Gammastrahlung ist ein wertvolles therapeutisches Mittel in der Krebsbehandlung, insbesondere bei Darmtumoren⁴⁰. Die Bestrahlung beeinträchtigt jedoch die Darmhomöostase erheblich, indem sie die Zellen schädigt, was zu Apoptose führt. Die Strahlenbelastung verursacht mehrere Störungen, die die Genesung eines Patienten verlangsamen, und ist gekennzeichnet durch Schleimhautverletzungen und Entzündungen in der akuten Phase und langfristig durch Durchfall, Inkontinenz, Blutungen und Bauchschmerzen. Diese Vielzahl von Erscheinungsformen wird als gastrointestinale Strahlentoxizität bezeichnet. Darüber hinaus kann sich das strahleninduzierte Fortschreiten der transmuralen Fibrose und/oder vaskulären Sklerose erst Jahre nach der Behandlung manifestieren^38,41. Gleichzeitig mit der Verletzung selbst induziert die Strahlung in den Darmzellen eine Reparaturreaktion, die Signalwege aktiviert, die für die Initiierung und Orchestrierung der Regeneration verantwortlich sind⁴². Eine strahleninduzierte Dünndarmerkrankung kann durch eine Strahlentherapie des Beckens oder des Abdomens mit anderen Organen (wie Gebärmutterhals, Prostata, Bauchspeicheldrüse, Rektum) verursacht werden41,43,44,45,46. Darmbestrahlungsschäden sind daher ein bedeutendes klinisches Problem, und ein besseres Verständnis der daraus resultierenden Pathophysiologie wird wahrscheinlich die Entwicklung von Interventionen zur Linderung der mit der Strahlentherapie verbundenen gastrointestinalen Komplikationen vorantreiben. Neben der Bestrahlung gibt es noch andere Techniken, die es ermöglichen, den regenerativen Zweck des Darmepithels zu untersuchen. Es wurden transgene und chemische Mausmodelle entwickelt, um Entzündungen und die anschließende Regeneration zu untersuchen⁴⁷. Dextran-Natriumsulfat (DSS) induziert Entzündungen im Darm und führt zur Entwicklung von Merkmalen, die denen einer entzündlichen Darmerkrankung ähneln⁴⁸. Eine Kombination der DSS-Behandlung mit dem prokarzinogenen Wirkstoff Azoxymethan (AOM) kann zur Entwicklung von Kolitis-assoziiertem Krebs führen^48,49. Die Ischämie-Reperfusions-induzierte Schädigung ist eine weitere Methode, um das regenerative Potenzial des Darmepithels zu untersuchen. Diese Technik erfordert Erfahrung und chirurgische Kenntnisse⁵⁰. Darüber hinaus verursachen die oben genannten Techniken andere Arten von Verletzungen als Strahlung und können dazu führen, dass andere Regenerationsmechanismen beteiligt sind. Darüber hinaus sind diese Modelle zeitaufwändig, während die Bestrahlungstechnik relativ kurz ist. In jüngster Zeit wurden In-vitro-Methoden unter Verwendung von Enteroiden und Kolonoiden, die aus dem Darm und dem Dickdarm erzeugt wurden, in Kombination mit Strahlenschäden eingesetzt, um die Mechanismen der Darmregeneration zu untersuchen^51,52. Diese Techniken rekapitulieren jedoch nicht vollständig das Organ, das sie modellieren^53,54.

Das vorgestellte Protokoll beinhaltet die Beschreibung eines murinen Modells der Gammastrahlenschädigung in Kombination mit einem genetischen Modell, das nach einer Tamoxifenbehandlung die Rückverfolgung von Abstammungslinien aus der Reservestammzellpopulation ermöglicht (Bmi1-Cre^ER; Rosa26^eYFP). Dieses Modell verwendet eine 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung, die eine ausreichend signifikante Darmschädigung induziert, um Reservestammzellen zu aktivieren, während gleichzeitig die anschließende Untersuchung der intestinalen Regenerationsfähigkeit innerhalb von 7 Tagen nach der Verletzung ermöglicht^{wird 55}.

Protocol

Alle Mäuse wurden in der Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) der Stony Brook University untergebracht. Das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stony Brook University genehmigte alle Studien und Verfahren mit Tierversuchen. Versuche mit Tieren wurden streng in Übereinstimmung mit dem genehmigten Tierhandhabungsprotokoll (IACUC #245094) durchgeführt. ANMERKUNG: Die Mausstämme B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) und B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYF…

Representative Results

Die Verwendung der 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung (SHT) in Kombination mit der genetischen Abstammungsverfolgung von Mäusen ermöglicht eine gründliche Analyse der Folgen von Strahlenschäden im Darm. Um zu beginnen, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-Mäuse erhielten eine einzige Tamoxifen-Injektion, die eine verstärkte Expression des gelb fluoreszierenden Proteins (EYFP) innerhalb einer Bmi1+ -Reservestammzellpopulation induziert. Zwei Tage nach der Tamoxifen-Injektion wurden die Mäuse e…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares Strahlenverletzungsmodell. Es ermöglicht die genaue Analyse der Veränderungen des Darmepithels im Verlauf von 7 Tagen nach der Verletzung. Wichtig ist, dass die ausgewählten Zeitpunkte entscheidende Stadien der Verletzung widerspiegeln und durch deutliche Veränderungen des Darms (Verletzungs-, Apoptose-, Regenerations- und Normalisierungsphasen) gekennzeichnet ^sind60. Dieses Bestrahlungsmodell wurde etabliert und sorgfältig bewerte…

Materials

1 mL syringe	BD	309659	–
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight	VWR	20068-630	–
27G x 1/2" needle	BD	305109	–
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe	Covidien	1188128012	–
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)	Santa Cruz Biotechnology	sc284628A	10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	22-026-213	–
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J	The Jackson Laboratory	Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J	The Jackson Laboratory	Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock	Millipore-Sigma	3116956001
Chicken anti-GFP	Aves	GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen	Thermo Fisher Scientific	C10638	–
Corn oil	Millipore-Sigma	C8267	–
Decloaking Chamber	Biocare Medical	DC2012	–
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher BioReagents	BP231-100	light sensitive
DNase-free proteinase K	Invitrogen	C10618H	diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647	Jackson ImmunoResearch	703-605-155
DPBS	Fisher Scientific	21-031-CV	–
Eosin	Fisher Scientific	S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X	Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	Millipore-Sigma	F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor	Best Theratronics Ltd.	–	0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488	Jackson ImmunoResearch	111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3	Millipore-Sigma	GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific	Fisher Scientific	23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)	Thermo Fisher Scientific	H3569	dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical	Fisher Scientific	18-603-252	–
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)	Millipore-Sigma	11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini	Fisher Scientific	DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	L119-500	0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL	VWR	89215-218	–
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398	–
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade	Capitol Scientific	AAP-281000ACSCSLT	–
Rabbit anti-Ki67	BioCare Medical	CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium	Fisher Scientific	22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree	Fisher Scientific	50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate	Fisher Scientific	S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit	VWR	25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]	VWR	48311-703
Tamoxifen	Millipore-Sigma	T5648	30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle	Sakura	4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades	Sakura	4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set	Sakura	4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid	Sakura	4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid	Sakura	4457
Tween 20	Millipore-Sigma	P7949
Unisette Processing Cassettes	VWR	87002-292	–
VWR Micro Cover Glasses	VWR	48393-081
Xylene	Fisher Scientific	X5P-1GAL