Une méthode biologique semi-automatisée et reproductible pour quantifier le dépôt de calcium in vitro

Summary

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde. La calcification vasculaire contribue considérablement au fardeau de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaires. Ce protocole décrit une méthode simple pour quantifier la précipitation du calcium médiée par les cellules musculaires lisses vasculaires in vitro par imagerie fluorescente.

Abstract

La calcification vasculaire implique une série de pathologies dégénératives, y compris l’inflammation, les modifications du phénotype cellulaire, la mort cellulaire et l’absence d’inhibiteurs de la calcification, qui entraînent simultanément une perte d’élasticité et de fonction des vaisseaux. La calcification vasculaire est un contributeur important à la morbidité et à la mortalité dans de nombreuses pathologies, y compris la maladie rénale chronique, le diabète sucré et l’athérosclérose. Les modèles de recherche actuels pour étudier la calcification vasculaire sont limités et ne sont viables qu’aux derniers stades du développement de la calcification in vivo. Les outils in vitro pour étudier la calcification vasculaire utilisent des mesures de point final, ce qui augmente les exigences en matière de matériel biologique et risque d’introduire de la variabilité dans les études de recherche. Nous démontrons l’application d’une nouvelle sonde marquée par fluorescence qui se lie au développement de la calcification in vitro sur les cellules musculaires lisses vasculaires humaines et détermine le développement en temps réel de la calcification in vitro . Dans ce protocole, nous décrivons l’application de notre nouveau test de calcification, un nouvel outil de modélisation des maladies qui a des applications translationnelles potentielles. Nous envisageons que ce test soit pertinent dans un spectre plus large de la recherche sur les dépôts minéraux, y compris les applications dans la recherche sur les os, le cartilage ou les dents.

Introduction

La calcification vasculaire (CV) est un facteur de risque indépendant de morbidité et de mortalité cardiovasculaires ^1,2,3. Longtemps considéré comme un processus chimique passif de dépôt de minéraux ectopiques, il apparaît aujourd’hui comme une réponse de cicatrisation tissulaire modifiable impliquant la contribution active de diverses cellules, y compris les cellules musculaires lisses vasculaires activées (hVSMC) comme moteur de la maladie ^4,5. In vivo La CV peut être mesurée par tomodensitométrie multicoupes comme évaluation de la charge athéroscléreuse ^6,7,8. Actuellement, un changement de paradigme est en cours, dans lequel la gravité de la CV est de plus en plus reconnue comme un facteur de risque de maladie cardiovasculaire, de diabète de type II, de maladie rénale chronique et de vieillissement 9,10,11,12,13,14,15.

Les hVSMC sont le type cellulaire le plus abondant dans le système cardiovasculaire et un acteur principal dans le développement de la CV. La calcification in vitro induite par hVSMC est un modèle de maladie largement utilisé pour étudier les maladies cardiovasculaires^16,17. Cependant, la plupart des protocoles de détection de la calcification in vitro utilisent des mesures de point final qui peuvent limiter l’acquisition de données, nécessitent une plus grande utilisation de matériel cellulaire et peuvent ralentir la recherche. Les méthodes courantes de détection de la calcification hVSMC in vitro comprennent le test o-crésolphtaléine, qui mesure le dépôt de calcium solubilisé par rapport aux protéines totales et nécessite une lyse cellulaire¹⁸. En outre, la coloration Alizarin Red est utilisée, qui se lie directement aux dépôts de calcium sur les cellules fixes ou les tissus¹⁹. Pour étudier la calcification de l’hVSMC au fil du temps avec l’o-crésolphtaléine ou le rouge d’Alizarine, il faut des lots de répétitions par point temporel, ce qui augmente la demande de matériel biologique et, par conséquent, augmente le risque de variabilité.

Dans cet article, nous détaillons la méthode d’application d’un nouveau test qui utilise des hVSMC avec une sonde d’imagerie fluorescente pour déterminer la progression in vitro de la CV ainsi que la fonction d’un test de calcification en phase terminale unique. Nous avons précédemment démontré que ce test est directement comparable aux méthodes o-crésolphtaléine et Alizarin Red et peut être utilisé pour distinguer différentes conditions de culture²⁰. En plus des mesures en temps réel, ce test peut être utilisé pour déterminer la propension des échantillons de sérum ou de plasma comme marqueur de substitution pour le développement clinique de CV²⁰. Cela facilitera l’application des stratégies biologiques des sciences cardiovasculaires et de la modélisation des maladies. Une autre application du test peut être en tant que système biohybride translationnel pour évaluer la gravité ou la progression de la CV à partir de constituants sanguins tels que le sérum ou le plasma.

Protocol

1. Ensemencement cellulaire, entretien et induction de calcification Pour la culture des cellules primaires, utilisez une armoire à flux d’air laminaire, des gants et du matériel stérile. Désinfectez les mains et l’espace de travail avant et après tout travail. Traiter toutes les cellules primaires et tous les milieux de culture comme présentant un risque biologique potentiel, sauf preuve contraire. De préférence, autoclaver les cellules et les milieux excédentaires avant l’élim…

Representative Results

Le résultat comprend des images originales de noyaux colorés par HOECHST, une calcification marquée par RFP et des images en fond clair. Différents stades de calcification allant de faible (Figure 2) à élevé (Figure 3) peuvent être détectés et analysés. La calcification peut généralement être repérée sous forme de taches noires à l’aide de la microscopie optique (Figure 2D et Figure 3B</strong…

Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode semi-automatisée pour la détermination de la calcification in vitro . Pour cette méthode, trois étapes critiques de la calcification hVSMC doivent être optimisées. Premièrement, la densité cellulaire est essentielle au développement de la calcification hVSMC. De faibles densités de VSMC hmc entraîneront une calcification lente ou nulle et la mort cellulaire en raison de l’absence de contact de cellule à cellule et du stress induit dans des conditions …

Materials

Calcium chloride, 93%, anhydrous	Thermo Fisher Scientific	349615000
Costar 6-well Clear TC-treated well plates	Corning	3516
Cytation 3 System	BioTek, Abcoude, The Netherlands
Fetal Bovine Serum	Merck	F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546	Prepared in-house
Gen5 Software v3.10	BioTek
Gibco Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H3570
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300062