ड्यूटेरियम-एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री शारीरिक स्थितियों के तहत अल्फा-सिन्यूक्लिन संरचनात्मक गतिशीलता के अध्ययन के लिए
Summary
मोनोमेरिक अल्फा-सिन्यूक्लिन का संरचनात्मक पहनावा इसके शारीरिक कार्य और भौतिक रासायनिक गुणों को प्रभावित करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि शारीरिक परिस्थितियों में इस आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन के मोनोमर पर रचनात्मक जानकारी निर्धारित करने के लिए मिलीसेकंड हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम-एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री और बाद के डेटा विश्लेषण कैसे करें।
Abstract
अल्फा-सिन्यूक्लिन (एएसवाईएन) एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन है जिसका फाइब्रिलर समुच्चय लेवी निकायों और न्यूराइट्स में प्रचुर मात्रा में होता है, जो पार्किंसंस रोग की पहचान हैं। फिर भी, इसकी अधिकांश जैविक गतिविधि, साथ ही इसके एकत्रीकरण में प्रोटीन का घुलनशील मोनोमर रूप शामिल है। एएसवाईएन जीव विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजी के आणविक तंत्र की व्याख्या के लिए संरचनात्मक रूप से अत्यधिक हल किए गए तरीकों की आवश्यकता होती है और जैविक स्थितियों के प्रति संवेदनशील होता है। इसकी मूल रूप से प्रकट, मेटा-स्थिर संरचनाएं मोनोमेरिक एसिन को कई संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीकों के लिए असभ्य बनाती हैं। यहां, इस तरह के एक दृष्टिकोण के आवेदन का वर्णन किया गया है: कम थर्मोडायनामिक स्थिरता और कमजोर सुरक्षा कारकों, जैसे कि एसिन के साथ प्रोटीन के अध्ययन के लिए मिलीसेकंड टाइमस्केल पर हाइड्रोजन / मिलीसेकंड टाइमस्केल पर, एचडीएक्स-एमएस डेटा में एसिन की विलायक पहुंच और हाइड्रोजन-बंधुआ संरचना के बारे में जानकारी होती है, जो लंबे समय तक लेबलिंग समय पर खो जाती है, अंततः अमीनो एसिड स्तर तक संरचनात्मक संकल्प उत्पन्न करती है। इसलिए, एचडीएक्स-एमएस विरूपण गतिशीलता और थर्मोडायनामिक्स, इंट्रा- और इंटर-आणविक इंटरैक्शन, और पर्यावरणीय परिस्थितियों में उत्परिवर्तन या परिवर्तन के संरचनात्मक प्रभाव पर उच्च संरचनात्मक और लौकिक संकल्पों पर जानकारी प्रदान कर सकता है। मोटे तौर पर लागू होने पर, यह प्रदर्शित किया जाता है कि मोनोमेरिक एसिन में मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस माप कैसे प्राप्त, विश्लेषण और व्याख्या करें।
Introduction
पार्किंसंस रोग (पीडी) एक न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी है जो दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करतीहै 1. यह साइटोप्लाज्मिक समावेशन के गठन की विशेषता है जिसे मस्तिष्क के मूल नाइग्रा पार्स कॉम्पैक्टा क्षेत्र में लेवी निकायों और लेवी न्यूराइट्स के रूप में जाना जाता है। इन साइटोप्लाज्मिक समावेशनों में आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन एसिन2 के समुच्चय पाए गए हैं। पीडी और अन्य सिन्यूक्लिनोपैथी में, एएसवाईएन घुलनशील अव्यवस्थित अवस्था से एक अघुलनशील, अत्यधिक संरचित रोगग्रस्त अवस्था में बदल जाता है। अपने मूल रूप में, मोनोमेरिक एसिन अपने एन- और सी-टर्मिनी के बीच लंबी दूरी के इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन और इसके सी-टर्मिनस और गैर-एमिलॉयड बीटा घटक (एनएसी) क्षेत्र 3,4,5,6 के बीच हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन द्वारा स्थिर रचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को गोद लेता है। उन स्थिर इंटरैक्शन में कोई भी व्यवधान, जैसे उत्परिवर्तन, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन, और स्थानीय वातावरण में परिवर्तन, मोनोमर के मिसफोल्डिंग का कारण बन सकता है, इस प्रकार एकत्रीकरण7 की प्रक्रिया को ट्रिगर कर सकता है।
जबकि एएसवाईएन 8,9,10,11 के ओलिगोमेरिक और फाइब्रिलर रूपों पर बड़ी मात्रा में शोध मौजूद है, प्रोटीन के मोनोमेरिक रूप का अध्ययन करने और बेहतर ढंग से समझने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है कि कौन से अनुरूप कार्यात्मक हैं (और कैसे) और जो कुल 8,9,10,11 से ग्रस्त हैं . आंतरिक रूप से अव्यवस्थित होने के नाते, आकार में केवल 14 केडीए, और क्रिस्टलीकृत करना मुश्किल है, एएसवाईएन मोनोमर अधिकांश संरचनात्मक जैविक तकनीकों के लिए उत्तरदायी नहीं है। हालांकि, मोनोमेरिक एसिन की रचनात्मक गतिशीलता को मापने में सक्षम एक तकनीक मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस है, जिसने हाल ही में महत्वपूर्ण संरचनात्मक टिप्पणियां उत्पन्न की हैं जो अन्यथा12,13,14 प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण या असंभव होगा। मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस संवेदनशील रूप से एमाइड हाइड्रोजन पर आइसोटोपिक एक्सचेंज की निगरानी करके प्रोटीन विरूपण पहनावा के औसत को मापता है, जो मिलीसेकंड टाइमस्केल पर एक विशेष प्रोटीन क्षेत्र की विलायक पहुंच और हाइड्रोजन-बॉन्डिंग नेटवर्क भागीदारी का संकेत देता है। एचडीएक्स-एमएस के मिलीसेकंड पहलू पर जोर देना आवश्यक है, क्योंकि इसकी मूल रूप से प्रकट, मेटा-स्थिर प्रकृति के कारण, एएसवाईएन बहुत तेजी से हाइड्रोजन-एक्सचेंज कैनेटीक्स प्रदर्शित करता है जो पारंपरिक एचडीएक्स-एमएस सिस्टम की निचली सीमा से नीचे अच्छी तरह से प्रकट होता है। उदाहरण के लिए, अधिकांश एएसवाईएन अणु ने 1 एस से कम समय में इंट्रासेल्युलर स्थितियों के तहत ड्यूटेरियम के लिए हाइड्रोजन का पूरी तरह से आदान-प्रदान किया है। कई प्रयोगशालाओं ने अब तेजी से मिश्रण इंस्ट्रूमेंटेशन का निर्माण किया है; इस मामले में, 50 एमएस के मृत समय के साथ एचडीएक्स-एमएस करने में सक्षम एक प्रोटोटाइप फास्ट-मिक्सिंग क्वेंच-फ्लो इंस्ट्रूमेंट और 1 एमएस के अस्थायी रिज़ॉल्यूशन का उपयोग15 किया जाता है। जबकि मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस हाल ही में एएसवाईएन के अध्ययन में तीव्रता से महत्वपूर्ण रहा है, यह आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन / क्षेत्रों का अधिक व्यापक रूप से अध्ययन करने में मूल्यवान है और छोरों / क्षेत्रों के साथ बड़ी संख्या में प्रोटीन जो केवल कमजोर रूप से स्थिर हैं। उदाहरण के लिए, पेप्टाइड दवाएं (जैसे, इंसुलिन; जीएलपी -1 / ग्लूकागन; टिर्जेपेटाइड) और पेप्टाइड-फ्यूजन प्रोटीन (जैसे, एचआईवी अवरोधक एफएन 3-एल 35-टी 1144) प्रमुख दवा प्रारूप हैं जहां समाधान-चरण संरचनात्मक और स्थिरता की जानकारी दवा विकास निर्णयों के लिए एक महत्वपूर्ण इनपुट हो सकती है, और फिर भी, पेप्टाइड मॉइटी अक्सर एचडीएक्स-एमएस द्वारा सेकंड टाइमस्केल16,17,18,19,20 पर केवल कमजोर रूप से स्थिर और असभ्य होता है . मिनट डोमेन में लेबलिंग के साथ आकस्मिक एचडीएक्स-एमएस विधियों को डीएनए जी-क्वाड्रप्लेक्स के लिए संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस21 के आवेदन द्वारा इसे अधिक विविध ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संरचनाओं तक विस्तारित करना संभव होना चाहिए।
एचडीएक्स-एमएस प्रयोगों को तीन अलग-अलग स्तरों पर किया जा सकता है: (1) बॉटम-अप (जिससे लेबल प्रोटीन प्रोटियोलिटिक रूप से पच जाता है), (2) मिडिल-डाउन (जिससे लेबल प्रोटीन प्रोटियोलिटिक रूप से पच जाता है, और परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स को नरम-विखंडन तकनीकों द्वारा आगे खंडित किया जाता है), और (3) टॉप-डाउन (जिससे नरम-विखंडन तकनीक सीधे लेबल प्रोटीन को खंडित करती है)22 . इस प्रकार, उप-आणविक एचडीएक्स-एमएस डेटा हमें प्रोटीन के विशिष्ट क्षेत्रों में विनिमय व्यवहार को स्थानीयकृत करने की अनुमति देता है, जिससे ऐसे प्रयोगों के लिए पर्याप्त अनुक्रम कवरेज होना महत्वपूर्ण हो जाता है। किसी भी एचडीएक्स-एमएस प्रयोग का संरचनात्मक संकल्प क्रमशः पाचन या नरम-विखंडन पर प्रोटीन से प्राप्त प्रोटियोलिटिक पेप्टाइड्स या टुकड़ों की संख्या पर निर्भर करता है। ऊपर उल्लिखित तीन प्रयोग प्रकारों में से प्रत्येक में, प्रत्येक पेप्टाइड /टुकड़े पर एमाइड एक्सचेंज में परिवर्तन प्रोटीन के स्थानीयकृत क्षेत्रों के व्यवहार को इंगित करने के लिए प्रोटीन की प्राथमिक संरचना पर वापस मैप किया जाता है। जबकि उच्चतम संरचनात्मक संकल्प नरम-विखंडन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है, इन प्रयोगों का विवरण वर्तमान अध्ययन के दायरे से बाहर है, जो एएसवाईएन मोनोमर रचनाओं के माप पर केंद्रित है। यहां वर्णित आमतौर पर लागू “बॉटम-अप” वर्कफ़्लो के साथ उत्कृष्ट परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।
यहां, प्रक्रियाएं (1) एएसआईएन नमूनों और एचडीएक्स-एमएस बफर को कैसे तैयार और संभालें, (2) बॉटम-अप एचडीएक्स-एमएस प्रयोग के लिए पेप्टाइड मैपिंग कैसे करें, (3) शारीरिक स्थितियों के तहत मोनोमेरिक एएसवाईएन पर एचडीएक्स-एमएस डेटा कैसे प्राप्त करें, विशेष रूप से मिलीसेकंड टाइम डोमेन में (कस्टम-निर्मित उपकरण का उपयोग करके; मिलीसेकंड लेबलिंग के लिए वैकल्पिक उपकरण भी वर्णित किए गए हैं), और (4) एचडीएक्स-एमएस डेटा को कैसे संसाधित और विश्लेषण करें। दो समाधान स्थितियों में शारीरिक पीएच (7.40) पर मोनोमेरिक एसिन का उपयोग करने के तरीके यहां उदाहरण दिए गए हैं। जबकि एएसवाईएन के अध्ययन में गंभीर रूप से उपयोगी है, इन प्रक्रियाओं को किसी भी प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन तक सीमित नहीं है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान लेख में, निम्नलिखित प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है: (1) उच्चतम अनुक्रम कवरेज प्राप्त करने के लिए मोनोमेरिक एएसवाईएन पर पेप्टाइड मैपिंग प्रयोग करना, (2) शारीरिक स्थितियों के तहत मोनोमेरिक एएसवा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनएस विश्वविद्यालय परिषद डायमंड जुबली छात्रवृत्ति द्वारा वित्त पोषित है। जेजेपी को यूकेआरआई फ्यूचर लीडर्स फैलोशिप [अनुदान संख्या: एमआर / टी 02223 एक्स / 1] द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| 1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
| Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
| Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
| Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
| Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
| DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
| Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
| Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
| Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
| HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
| LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
| Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
| MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
| Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2 |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
| Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
| ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
| Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
| ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
| Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
| Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2 |
| Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
| Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
| Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
| Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
| VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |
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