Det strukturelle ensemblet av monomer alfa-synuclein påvirker dets fysiologiske funksjon og fysisk-kjemiske egenskaper. Denne protokollen beskriver hvordan man utfører millisekund hydrogen / deuterium-utveksling massespektrometri og påfølgende dataanalyser for å bestemme konformasjonsinformasjon om monomeren til dette iboende uordnede proteinet under fysiologiske forhold.
Alfa-synuclein (aSyn) er et indre uordnet protein hvis fibrillære aggregater er rikelig i Lewy-legemer og nevritter, som er kjennetegnene til Parkinsons sykdom. Likevel involverer mye av sin biologiske aktivitet, så vel som aggregering, sentralt den løselige monomerformen av proteinet. Belysning av de molekylære mekanismene i aSyn biologi og patofysiologi krever strukturelt svært oppløste metoder og er følsom for biologiske forhold. Dens naturlig utfoldede, metastabile strukturer gjør monomer aSyn ugjennomtrengelig for mange strukturbiologiske teknikker. Her beskrives anvendelsen av en slik tilnærming: hydrogen / deuterium-utveksling massespektrometri (HDX-MS) på millisekund tidsskalaen for studier av proteiner med lav termodynamisk stabilitet og svake beskyttelsesfaktorer, for eksempel aSyn. På millisekundets tidsskala inneholder HDX-MS-data informasjon om løsningsmiddeltilgjengeligheten og hydrogenbundet struktur av aSyn, som går tapt ved lengre merkingstider, noe som til slutt gir strukturell oppløsning opp til aminosyrenivået. Derfor kan HDX-MS gi informasjon ved høye strukturelle og tidsmessige oppløsninger om konformasjonsdynamikk og termodynamikk, intra- og intermolekylære interaksjoner, og den strukturelle virkningen av mutasjoner eller endringer i miljøforhold. Selv om det er bredt anvendelig, demonstreres det hvordan man anskaffer, analyserer og tolker millisekund HDX-MS-målinger i monomere aSyn.
Parkinsons sykdom (PD) er en nevrodegenerativ sykdom som påvirker millioner av mennesker over hele verden1. Det er preget av dannelsen av cytoplasmatiske inneslutninger kjent som Lewy-legemer og Lewy-neuritter i hjernens substantia nigra pars compacta-region. Disse cytoplasmatiske inneslutningene har vist seg å inneholde aggregater av det indre uordnede proteinet aSyn2. I PD og andre synukleinopatier transformerer aSyn fra en løselig uordnet tilstand til en uoppløselig, svært strukturert syk tilstand. I sin opprinnelige form vedtar monomere aSyn et bredt spekter av konformasjoner stabilisert av langdistanse elektrostatiske interaksjoner mellom N- og C-termini og hydrofobe interaksjoner mellom C-terminalen og ikke-amyloid beta-komponent (NAC) region 3,4,5,6. Eventuelle forstyrrelser i de stabiliserende interaksjonene, for eksempel mutasjoner, posttranslasjonelle modifikasjoner og endringer i det lokale miljøet, kan føre til feilfolding av monomeren, og dermed utløse prosessen med aggregering7.
Mens det finnes en enorm mengde forskning på oligomere og fibrillære former av aSyn 8,9,10,11, er det et avgjørende behov for å studere proteinets monomere form og bedre forstå hvilke konformatorer som er funksjonelle (og hvordan) og hvilke som er tilbøyelige til å samle 8,9,10,11 . Å være iboende uordnet, bare 14 kDa i størrelse og vanskelig å krystallisere, er aSyn-monomeren ikke mottagelig for de fleste strukturelle biologiske teknikker. Imidlertid er en teknikk som er i stand til å måle konformasjonsdynamikken til monomer aSyn millisekund HDX-MS, som nylig har generert viktige strukturelle observasjoner som ville være utfordrende eller umulig å oppnå ellers 12,13,14. Millisekund HDX-MS måler følsomt gjennomsnittet av proteinkonformasjonsensemblet ved å overvåke isotoputvekslingen ved amidhydrogensere, noe som indikerer løsemiddeltilgjengelighet og hydrogenbindingsnettverksdeltakelse av et bestemt proteinområde på millisekundets tidsskala. Det er nødvendig å understreke millisekundaspektet av HDX-MS, da aSyn på grunn av sin opprinnelig utfoldede, metastabile natur utviser veldig rask hydrogenutvekslingskinetikk som manifesterer seg godt under den nedre grensen for konvensjonelle HDX-MS-systemer. For eksempel har det meste av aSyn-molekylet fullstendig utvekslet hydrogen for deuterium under intracellulære forhold på mindre enn 1 s. Flere laboratorier har nå bygget hurtigblande instrumentering; i dette tilfellet brukes et prototype raskt blandende slukkeflytinstrument som er i stand til å utføre HDX-MS med en dødtid på 50 ms og en tidsmessig oppløsning på 1 ms15. Mens millisekund HDX-MS nylig har vært akutt viktig i studiet av aSyn, står det å være verdifullt for å studere iboende uordnede proteiner / regioner i større grad og et stort antall proteiner med løkker / regioner som bare er svakt stabile. For eksempel, peptidmedikamenter (f.eks. insulin; GLP-1/glukagon; tirzepatid) og peptidfusjonsproteiner (f.eks. HIV-hemmeren FN3-L35-T1144) er viktige legemiddelformater der struktur- og stabilitetsinformasjon i løsningsfasen kan være en kritisk inngang for beslutninger om legemiddelutvikling, og likevel er peptiddelen ofte bare svakt stabil og ugjennomtrengelig av HDX-MS på sekundene tidsskala 16,17,18,19,20 . Emergent HDX-MS metoder med merking i sekunder / minutter domener har vist seg å utlede strukturell informasjon for DNA G-quadruplexes, men det bør være mulig å utvide dette til mer variert oligonukleotid strukturer ved anvendelse av millisekund HDX-MS21.
HDX-MS-eksperimenter kan utføres på tre forskjellige nivåer: (1) bottom-up (hvor det merkede proteinet fordøyes proteolytisk), (2) middle-down (hvorved det merkede proteinet fordøyes proteolytisk, og de resulterende peptidene fragmenteres ytterligere ved myke fragmenteringsteknikker), og (3) top-down (hvorved myke fragmenteringsteknikker direkte fragmenterer det merkede proteinet)22 . Dermed tillater submolekylære HDX-MS-data oss å lokalisere utvekslingsadferden til bestemte regioner av et protein, noe som gjør det kritisk å ha tilstrekkelig sekvensdekning for slike eksperimenter. Den strukturelle oppløsningen til ethvert HDX-MS-eksperiment er avhengig av antall proteolytiske peptider eller fragmenter avledet fra proteinet ved fordøyelse eller myk fragmentering, henholdsvis. I hver av de tre eksperimenttypene som er skissert ovenfor, kartlegges endringen i amidutveksling ved hvert peptid / fragment tilbake på proteinets primære struktur for å indikere oppførselen til lokaliserte regioner av proteinet. Mens den høyeste strukturelle oppløsningen oppnås gjennom myk fragmentering, er beskrivelsen av disse eksperimentene utenfor omfanget av den nåværende studien, som fokuserer på måling av aSyn-monomerkonformasjoner. Utmerkede resultater kan oppnås med den ofte brukte “bottom-up” arbeidsflyten som er beskrevet her.
Her er det gitt prosedyrer for (1) hvordan man preparerer og håndterer aSyn-prøver og HDX-MS-buffere, (2) hvordan man utfører peptidkartlegging for et bottom-up HDX-MS-eksperiment, (3) hvordan man skaffer HDX-MS-data om monomere aSyn under fysiologiske forhold, spesielt i millisekund-tidsdomenet (ved hjelp av et spesialbygd instrument; alternative instrumenter for millisekundmerking er også beskrevet), og (4) hvordan du behandler og analyserer HDX-MS-dataene. Metoder som bruker monomer aSyn ved fysiologisk pH (7,40) i to løsningsforhold er eksemplifisert her. Selv om det er kritisk nyttig i studiet av aSyn, kan disse prosedyrene brukes på ethvert protein og er ikke begrenset til egentlig uordnede proteiner.
I denne artikkelen beskrives følgende prosedyrer: (1) utføre peptidkartleggingseksperimenter på monomere aSyn for å oppnå den høyeste sekvensdekningen, (2) anskaffe millisekund HDX-MS-data på monomere aSyn under fysiologiske forhold, og (3) utføre dataanalyse og tolkning av de resulterende HDX-MS-dataene. De angitte prosedyrene er generelt enkle å utføre, hvert merkingseksperiment varer vanligvis bare rundt 8 timer i tre replikasjoner og åtte tidspunkter, og kartleggingseksperimentet varer bare rundt 2 timer. …
The authors have nothing to disclose.
NS er finansiert av Universitetsrådets diamantjubileumsstipend. JJP støttes av et UKRI Future Leaders Fellowship [Grant number: MR/T02223X/1].
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2 |
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |