عزل خلايا سلالة البلاعم أحادية الخلية عن عظام الفئران بطريقة الالتصاق الثانوية
Summary
هنا نقدم بروتوكولا لعزل BMMs عن الفئران SD ، يسمى طريقة الالتزام الثانوية.
Abstract
مع انخفاض كثافة المعادن في العظام ، تكون العظام أكثر عرضة للكسر ، مما يؤثر سلبا على نوعية حياة المريض. يتم تنظيم نمو وتطور العظام بشكل رئيسي بواسطة الخلايا العظمية والخلايا الآكلة للعظام. وقد تم قبوله على نطاق واسع أن الخلايا العظمية الخلية مشتقة من خلايا البلاعم وحيدة الخلايا العظمية (BMMs). توجد BMMs وغيرها من الخلايا الجذعية المكونة للدم في تجويف نخاع العظام. لذلك ، فإن عزل BMMs المستقرة الواحدة من مجموعات الخلايا المختلفة وغير المتجانسة يمثل تحديا كبيرا. هنا نقدم بروتوكولا لعزل BMMs عن الفئران SD ، يسمى طريقة الالتزام الثانوية. تم جمع الخلايا الملتصقة المستزرعة لمدة 24-48 ساعة في الثقافة الأولية. أظهر تحليل التدفق الخلوي أن ما يقرب من 37.94٪ من الخلايا كانت CD11b / c + (مستضد سطح البلاعم الأحادي). أظهر تلطيخ الفوسفاتيز الحمضي المقاوم للطرطرات (TRAP) وتحليل اللطخة الغربية أن BMMs يمكن أن تتمايز إلى خلايا عظمية في المختبر. تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى أنه يمكن اعتبار خلايا الالتصاق الثانوية نموذجا خلويا مناسبا لأبحاث تمايز الخلايا العظمية.
Introduction
وقد أفيد أن خلايا سلالة البلاعم الأحادية الموجودة في نخاع العظم يمكن أن تتمايز إلى خلايا وحيدة الدم والبلاعم النسيجية 1,2. تستخدم الخلايا المذكورة أعلاه ، والتي يمكن أن تتمايز إلى خلايا عظمية لتحقيق التوازن بين نمو العظام وتطورها ، كنموذج خلوي لحث الخلايا على الخلايا العظمية في الجسم الحي 3,4. نخاع العظم هو نسيج خاص يحتوي على عدة أنواع مختلفة من الخلايا ، والتي تشمل على سبيل المثال لا الحصر الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم ، وخلايا البلاعم أحادية الخلايا (BMMs) ، والخلايا الجذعية المكونة للدم ، والخلايا البطانية ، والخلايا المناعية. في الواقع ، أشارت العديد من الدراسات السابقة إلى أن الخلايا الملتصقة التي خرجت من تجويف نخاع العظم للعظم الطويل يمكن أن تتمايز إلى خلايا عظمية أو خلايا عظمية أو خلايا غضروفية أو خلايا دهنية5،6،7،8. على الرغم من استخدام طرق عزل وزراعة مختلفة لإنتاج مجموعات خلايا متجانسة مختلفة ، إلا أنه لا تزال هناك تحديات كبيرة في عزل وزراعة BMMs من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المختلفة.
تم تطوير عدة طرق لاستخراج البلاعم أحادية النواة في نخاع العظم (BMSCs). ومع ذلك ، فإن غالبية هذه الطرق معقدة9،10،11. على سبيل المثال ، يتطلب الطرد المركزي لتدرج الكثافة مجموعة متخصصة وتستغرق العملية وقتا طويلا ومرهقة. هذه الطريقة مناسبة لعزل BMMs من عينات الدم كبيرة الحجم ، ولكن ليس من عينات نخاع العظم9،12،13. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخراج عينات الأنسجة باستخدام هضم الكولاجيناز هو إجراء معقد ويستغرق وقتا طويلا. لا ينصح بهذه الطريقة لعزل BMMs من عينات نخاع العظم14,15. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن فصل التدفق يمكن أن يؤدي إلى مجموعات أحادية / بلاعم عالية النقاء ، إلا أنه يتطلب أحجام عينات كبيرة جدا ومتطلبات عالية من الأدوات والمعدات10,16. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طريقة إثراء الميكروبيدات مكلفة للغاية وغير مجدية في مختبر عام17.
لذلك ، في الدراسة الحالية تم اقتراح طريقة مريحة وسريعة ورخيصة لعزل البلاعم أحادية النواة عن نخاع العظام. تم استخدام خلايا نخاع العظم الملتصقة بنقاط زمنية مختلفة لعزل BMMs باستخدام طريقة الالتصاق الثانوية. يمكن أن تحفز BMMs المستخرجة بالطريقة المذكورة أعلاه على تكوين الخلايا العظمية في المختبر ، وبالتالي توفير نموذج خلية بسيط ومريح للدراسة المستقبلية لهشاشة العظام في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخلايا العظمية هي واحدة من أهم أنواع الخلايا المشاركة في حدوث وتطور أمراض العظام ، وكذلك واحدة من الأشياء الأساسية لأبحاث أمراض العظام20. يمكن أن تتمايز الخلايا الأحادية / البلاعم إلى خلايا عظمية. نظرا لأن البلاعم أحادية النواة (خلايا RAW264.7) مكلفة للغاية ويمكن تنشيطها بسهولة أ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (رقم المنحة. LY19H060001) ومشروع خطة تشجيانغ للعلوم والتكنولوجيا الصينية التقليدية (رقم 2022ZB093).
Materials
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
References
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
- Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
- Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
- Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
- Horowitz, M. C., et al. marrow adipocytes. Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).
- Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
- Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
- Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
- Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657 (2020).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759 (2008).
- Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550 (2019).
- Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
- Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).
