Isolering af monocyt-makrofag-afstamningsceller fra rotteben ved sekundær adhærens metode
Summary
Her præsenterer vi en protokol til isolering afBMM’er fra SD-rotter, kaldet den sekundære adhærens metode.
Abstract
Med et fald i knoglemineraltætheden er knogler mere tilbøjelige til at bryde, hvilket påvirker patientens livskvalitet negativt. Væksten og udviklingen af knogler reguleres hovedsageligt af osteoblaster og osteoklaster. Det er blevet bredt accepteret, at osteoklaster stammer fra knoglemarv monocyt-makrofagceller (BMM’er). BBM’er og andre hæmatopoietiske stamceller er placeret i knoglemarvshulen. Derfor er det en enorm udfordring at isolere enkeltstabileBM’er fra forskellige og heterogene cellepopulationer. Her præsenterer vi en protokol til isolering afBMM’er fra SD-rotter, kaldet den sekundære adhærens metode. Vedhængende celler dyrket i 24-48 timer i primær kultur blev indsamlet. Flowcytometrisk analyse viste, at ca. 37,94% af cellerne var CD11b / c + (monocyt-makrofag overfladeantigen). Tartratresistent syrefosfatase (TRAP) farvning og western blot analyse viste, at BBM’er kunne differentieres til osteoklaster in vitro. Ovenstående resultater antydede, at de sekundære adhærensceller kunne betragtes som en passende cellulær model til osteoklastdifferentieringsforskning.
Introduction
Det er blevet rapporteret, at monocyt-makrofag-afstamningsceller, der findes i knoglemarven, kan differentiere sig til blodmonocytter og vævsmakrofager 1,2. Ovennævnte celler, som kan differentiere sig til osteoklaster for at afbalancere knoglevækst og udvikling, anvendes almindeligvis som en cellemodel til at inducere osteoklaster in vivo 3,4. Knoglemarv er et specielt væv, der indeholder flere forskellige typer celler, som omfatter, men ikke kun er begrænset til knoglemarv mesenkymale stamceller, knoglemarv monocyt-makrofagceller (BMM’er), hæmatopoietiske stamceller, endotelceller og immunceller. Faktisk antydede flere tidligere undersøgelser, at vedhængende celler, der skyndte sig ud af knoglemarvshulen i den lange knogle, kunne differentiere sig til osteoblaster, osteoklaster, kondrocytter eller adipocytter 5,6,7,8. Selvom forskellige isolations- og dyrkningsmetoder er blevet brugt til at producere forskellige homogene cellepopulationer, er der stadig store udfordringer med at isolere og dyrkeBM’er fra en række forskellige celletyper.
Flere metoder er blevet udviklet til at ekstrahere knoglemarv mononukleære makrofager (BMSC’er). Imidlertid er størstedelen af disse metoder komplekse 9,10,11. For eksempel kræver densitetsgradientcentrifugering et specialiseret sæt, og operationen er tidskrævende og besværlig. Denne metode er egnet til isolering af BMI fra højvolumen blodprøver, men ikke fra knoglemarvsprøver 9,12,13. Derudover er ekstraktion af vævsprøver ved hjælp af collagenasefordøjelse en kompleks og tidskrævende procedure; denne metode anbefales ikke til isolering af BBM’er fra knoglemarvsprøver14,15. Hertil kommer, at selvom flowadskillelse kan resultere i stærkt oprensede monocyt/makrofagpopulationer, kræver det meget store prøvestørrelser og høje instrument- og udstyrskrav10,16. Derudover er mikrobeadberigelsesmetoden ekstremt dyr og er ikke mulig i et generelt laboratorium17.
Derfor blev der i den nuværende undersøgelse foreslået en bekvem, hurtig og billig metode til isolering af mononukleære makrofager fra knoglemarven. Knoglemarvsceller klæbet til forskellige tidspunkter blev brugt til at isolereBMM’er ved hjælp af en sekundær adhærensmetode. BBM’er ekstraheret med ovennævnte metode kunne inducere dannelsen af osteoklaster in vitro og dermed give en enkel og bekvem cellemodel til den fremtidige undersøgelse af osteoporose in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoklaster er en af de mest betydningsfulde celletyper, der er involveret i forekomsten og udviklingen af knoglesygdomme, samt et af de primære objekter for knoglesygdomsforskning20. Monocyt / makrofager kan differentiere sig til osteoklaster. Da mononukleære makrofager (RAW264.7-celler) er for dyre at købe og let aktiveres under dyrkning, er det vanskeligt at udføre in vitro-differentieringseksperimenter ved hjælp af denne cellelinje. Selvom der er udviklet flere metoder til ekstr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Natural Science Foundation of Zhejiang Province (tilskudsnr. LY19H060001) og Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (nr. 2022ZB093).
Materials
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
References
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
- Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
- Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
- Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
- Horowitz, M. C., et al. marrow adipocytes. Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).
- Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
- Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
- Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
- Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657 (2020).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759 (2008).
- Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550 (2019).
- Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
- Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).
