Isolatie van monocyten-macrofaaglijncellen uit rattenbotten door secundaire therapietrouwmethode
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van BMM’s van SD-ratten, de secundaire therapietrouwmethode genoemd.
Abstract
Met een afname van de botmineraaldichtheid hebben botten meer kans om te breken, waardoor de kwaliteit van leven van een patiënt negatief wordt beïnvloed. De groei en ontwikkeling van botten worden voornamelijk gereguleerd door osteoblasten en osteoclasten. Het is algemeen aanvaard dat osteoclasten zijn afgeleid van beenmergmonocyten-macrofaagcellen (BMM’s). BMM’s en andere hematopoëtische stamcellen bevinden zich in de beenmergholte. Daarom is het isoleren van enkele stabiele BMM’s van verschillende en heterogene celpopulaties een enorme uitdaging. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van BMM’s van SD-ratten, de secundaire therapietrouwmethode genoemd. Adherente cellen gekweekt gedurende 24-48 uur in primaire cultuur werden verzameld. Flowcytometrische analyse toonde aan dat ongeveer 37,94% van de cellen CD11b/c+ (monocyte-macrofaag oppervlakteantigeen) waren. Tartraatresistente zuurfosfatase (TRAP) kleuring en western blot analyse toonden aan dat BMM’s in vitro konden differentiëren in osteoclasten. De bovenstaande bevindingen suggereerden dat de secundaire adherentiecellen kunnen worden beschouwd als een geschikt cellulair model voor onderzoek naar osteoclastendifferentiatie.
Introduction
Er is gemeld dat monocyten-macrofaag afstammingscellen in het beenmerg kunnen differentiëren in bloedmonocyten en weefselmacrofagen 1,2. De bovenstaande cellen, die kunnen differentiëren in osteoclasten om botgroei en -ontwikkeling in evenwicht te brengen, worden vaak gebruikt als een celmodel om osteoclasten in vivo te induceren 3,4. Beenmerg is een speciaal weefsel dat verschillende soorten cellen bevat, waaronder maar niet alleen beperkt tot mesenchymale stamcellen in het beenmerg, beenmergmonocyten-macrofaagcellen (BMM’s), hematopoëtische stamcellen, endotheelcellen en immuuncellen. In feite suggereerden verschillende eerdere studies dat aanhankelijke cellen die uit de beenmergholte van het lange bot werden gehaast, konden differentiëren in osteoblasten, osteoclasten, chondrocyten of adipocyten 5,6,7,8. Hoewel verschillende isolatie- en kweekmethoden zijn gebruikt om verschillende homogene celpopulaties te produceren, zijn er nog steeds grote uitdagingen bij het isoleren en kweken van BMM’s uit een verscheidenheid aan verschillende celtypen.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om mononucleaire macrofagen (BMSC’s) in het beenmerg te extraheren. De meeste van deze methoden zijn echter complex 9,10,11. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie vereist bijvoorbeeld een gespecialiseerde kit en de bewerking is tijdrovend en omslachtig. Deze methode is geschikt voor de isolatie van BMM’s uit bloedmonsters met een hoog volume, maar niet uit beenmergmonsters 9,12,13. Bovendien is het extraheren van weefselmonsters met behulp van collagenasevertering een complexe en tijdrovende procedure; deze methode wordt niet aanbevolen voor de isolatie van BMM’s uit beenmergmonsters14,15. Bovendien, hoewel stroomscheiding kan resulteren in sterk gezuiverde monocyten/ macrofaagpopulaties, vereist het zeer grote steekproefgroottes en hoge instrument- en apparatuurvereisten10,16. Bovendien is de microbead-verrijkingsmethode extreem duur en niet haalbaar in een algemeen laboratorium17.
Daarom werd in de huidige studie een handige, snelle en goedkope methode voorgesteld voor de isolatie van mononucleaire macrofagen uit het beenmerg. Beenmergcellen die voor verschillende tijdspunten werden gehecht, werden gebruikt om BMM’s te isoleren met behulp van een secundaire hechtingsmethode. BMM’s geëxtraheerd met de bovenstaande methode kunnen de vorming van osteoclasten in vitro induceren, waardoor een eenvoudig en handig celmodel wordt geboden voor de toekomstige studie van osteoporose in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoclasten zijn een van de belangrijkste celtypen die betrokken zijn bij het optreden en de ontwikkeling van botziekten, evenals een van de primaire objecten van onderzoek naar botziekten20. Monocyten/macrofagen kunnen differentiëren in osteoclasten. Omdat mononucleaire macrofagen (RAW264.7-cellen) te duur zijn om te kopen en gemakkelijk worden geactiveerd tijdens het kweken, is het moeilijk om in vitro differentiatie-experimenten uit te voeren met behulp van deze cellijn. Hoewel er ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang (subsidienr. LY19H060001) en het Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (nr. 2022ZB093).
Materials
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
References
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
- Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
- Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
- Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
- Horowitz, M. C., et al. marrow adipocytes. Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).
- Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
- Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
- Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
- Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657 (2020).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759 (2008).
- Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550 (2019).
- Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
- Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).
