Isolement des cellules de la lignée monocyte-macrophage à partir d’os de rat par la méthode d’adhérence secondaire
Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des BMM chez les rats SD, appelé méthode d’observance secondaire.
Abstract
Avec une diminution de la densité minérale osseuse, les os sont plus susceptibles de se fracturer, affectant ainsi négativement la qualité de vie d’un patient. La croissance et le développement des os sont principalement régulés par les ostéoblastes et les ostéoclastes. Il a été largement admis que les ostéoclastes sont dérivés de cellules monoculo-macrophages (BMM) de la moelle osseuse. Les BMM et autres cellules souches hématopoïétiques sont situées dans la cavité de la moelle osseuse. Par conséquent, isoler des BMM stables uniques à partir de populations cellulaires différentes et hétérogènes est un énorme défi. Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des BMM chez les rats SD, appelé méthode d’observance secondaire. Des cellules adhérentes cultivées pendant 24 à 48 h en culture primaire ont été collectées. L’analyse cytométrique en flux a montré qu’environ 37,94 % des cellules étaient CD11b/c+ (antigène de surface monocyte-macrophage). La coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) et l’analyse par transfert western ont démontré que les MGM pouvaient se différencier en ostéoclastes in vitro. Les résultats ci-dessus suggèrent que les cellules d’adhérence secondaires pourraient être considérées comme un modèle cellulaire approprié pour la recherche sur la différenciation des ostéoclastes.
Introduction
Il a été rapporté que les cellules de la lignée monocyte-macrophage existant dans la moelle osseuse peuvent se différencier en monocytes sanguins et macrophages tissulaires 1,2. Les cellules ci-dessus, qui peuvent se différencier en ostéoclastes pour équilibrer la croissance et le développement osseux, sont couramment utilisées comme modèle cellulaire pour induire des ostéoclastes in vivo 3,4. La moelle osseuse est un tissu spécial contenant plusieurs types de cellules, qui comprennent, mais ne sont pas limités aux cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse, aux cellules monocytaires-macrophages de la moelle osseuse (BMM), aux cellules souches hématopoïétiques, aux cellules endothéliales et aux cellules immunitaires. En fait, plusieurs études antérieures ont suggéré que les cellules adhérentes se précipitaient hors de la cavité de la moelle osseuse de l’os long pourraient se différencier en ostéoblastes, ostéoclastes, chondrocytes ou adipocytes 5,6,7,8. Bien que différentes méthodes d’isolement et de culture aient été utilisées pour produire différentes populations cellulaires homogènes, il existe encore de grands défis dans l’isolement et la culture de MGM à partir d’une variété de types cellulaires différents.
Plusieurs méthodes ont été mises au point pour extraire les macrophages mononucléaires de la moelle osseuse (BMSC). Cependant, la majorité de ces méthodes sont complexes 9,10,11. Par exemple, la centrifugation par gradient de densité nécessite un kit spécialisé et l’opération prend du temps et est lourde. Cette méthode convient à l’isolement des BMM à partir d’échantillons de sang à volume élevé, mais pas d’échantillons de moelle osseuse 9,12,13. En outre, l’extraction d’échantillons de tissus à l’aide de la digestion à la collagénase est une procédure complexe et longue; cette méthode n’est pas recommandée pour l’isolement des BMM à partir d’échantillons de moelle osseuse14,15. En outre, bien que la séparation des flux puisse entraîner des populations de monocytes/macrophages hautement purifiées, elle nécessite des échantillons de très grande taille et des exigences élevées en instruments et en équipement10,16. De plus, la méthode d’enrichissement des microbilles est extrêmement coûteuse et n’est pas réalisable dans un laboratoire général17.
Par conséquent, dans la présente étude, une méthode pratique, rapide et bon marché a été proposée pour isoler les macrophages mononucléaires de la moelle osseuse. Les cellules de la moelle osseuse adhérées à différents moments ont été utilisées pour isoler les MMO à l’aide d’une méthode d’adhérence secondaire. Les BMM extraits avec la méthode ci-dessus pourraient induire la formation d’ostéoclastes in vitro, fournissant ainsi un modèle cellulaire simple et pratique pour l’étude future de l’ostéoporose in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les ostéoclastes sont l’un des types de cellules les plus importants impliqués dans l’apparition et le développement de maladies osseuses, ainsi que l’un des principaux objets de la recherche sur les maladiesosseuses 20. Les monocytes/macrophages peuvent se différencier en ostéoclastes. Étant donné que les macrophages mononucléaires (cellules RAW264.7) sont trop chers à l’achat et sont facilement activés pendant la culture, il est difficile d’effectuer des expériences de d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (subvention no. LY19H060001) et le projet de plan scientifique et technologique de la médecine traditionnelle chinoise du Zhejiang (n° 2022ZB093).
Materials
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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