Isolamento delle cellule di lignaggio monociti-macrofagi dalle ossa di ratto mediante metodo di aderenza secondaria
Summary
Qui presentiamo un protocollo per l’isolamento dei BMM dai ratti SD, chiamato metodo di aderenza secondaria.
Abstract
Con una diminuzione della densità minerale ossea, le ossa hanno maggiori probabilità di fratturarsi, influenzando così negativamente la qualità della vita di un paziente. La crescita e lo sviluppo delle ossa sono regolati principalmente da osteoblasti e osteoclasti. È stato ampiamente accettato che gli osteoclasti sono derivati da cellule monociti-macrofagi del midollo osseo (BMM). BMM e altre cellule staminali ematopoietiche si trovano nella cavità del midollo osseo. Pertanto, isolare singoli BBM stabili da popolazioni cellulari diverse ed eterogenee è una sfida enorme. Qui presentiamo un protocollo per l’isolamento dei BMM dai ratti SD, chiamato metodo di aderenza secondaria. Sono state raccolte cellule aderenti coltivate per 24-48 ore in coltura primaria. L’analisi citometrica a flusso ha mostrato che circa il 37,94% delle cellule erano CD11b/c+ (antigene di superficie monocita-macrofago). La colorazione della fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP) e l’analisi western blot hanno dimostrato che i BMM potrebbero differenziarsi in osteoclasti in vitro. I risultati di cui sopra hanno suggerito che le cellule di aderenza secondaria potrebbero essere considerate come un modello cellulare adatto per la ricerca sulla differenziazione degli osteoclasti.
Introduction
È stato riportato che le cellule di lignaggio monociti-macrofagi esistenti nel midollo osseo possono differenziarsi in monociti del sangue e macrofagi tissutali 1,2. Le cellule di cui sopra, che possono differenziarsi in osteoclasti per bilanciare la crescita e lo sviluppo osseo, sono comunemente usate come modello cellulare per indurre osteoclasti in vivo 3,4. Il midollo osseo è un tessuto speciale contenente diversi tipi di cellule, che includono, ma non sono solo limitate alle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo, alle cellule monociti-macrofagi del midollo osseo (BMM), alle cellule staminali ematopoietiche, alle cellule endoteliali e alle cellule immunitarie. In effetti, diversi studi precedenti hanno suggerito che le cellule aderenti si sono precipitate fuori dalla cavità del midollo osseo dell’osso lungo potrebbero differenziarsi in osteoblasti, osteoclasti, condrociti o adipociti 5,6,7,8. Sebbene siano stati utilizzati diversi metodi di isolamento e coltura per produrre diverse popolazioni cellulari omogenee, ci sono ancora grandi sfide nell’isolamento e nella coltura di BMM da una varietà di diversi tipi di cellule.
Sono stati sviluppati diversi metodi per estrarre macrofagi mononucleati del midollo osseo (BMSC). Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono complessi 9,10,11. Ad esempio, la centrifugazione a gradiente di densità richiede un kit specializzato e l’operazione richiede tempo e ingombro. Questo metodo è adatto per l’isolamento di BMM da campioni di sangue ad alto volume, ma non da campioni di midollo osseo 9,12,13. Inoltre, l’estrazione di campioni di tessuto utilizzando la digestione della collagenasi è una procedura complessa e dispendiosa in termini di tempo; questo metodo non è raccomandato per l’isolamento di BMM da campioni di midollo osseo14,15. Inoltre, sebbene la separazione del flusso possa portare a popolazioni di monociti / macrofagi altamente purificate, richiede dimensioni del campione molto grandi e requisiti elevati di strumenti e attrezzature10,16. Inoltre, il metodo di arricchimento delle microsfere è estremamente costoso e non è fattibile in un laboratorio generale17.
Pertanto, nel presente studio è stato proposto un metodo conveniente, veloce ed economico per l’isolamento dei macrofagi mononucleati dal midollo osseo. Le cellule del midollo osseo aderenti per diversi punti temporali sono state utilizzate per isolare i BMM utilizzando un metodo di aderenza secondaria. I BMM estratti con il metodo di cui sopra potrebbero indurre la formazione di osteoclasti in vitro, fornendo così un modello cellulare semplice e conveniente per il futuro studio dell’osteoporosi in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli osteoclasti sono uno dei tipi di cellule più significativi coinvolti nell’insorgenza e nello sviluppo di malattie ossee, nonché uno degli oggetti primari della ricerca sulle malattie ossee20. Monociti / macrofagi possono differenziarsi in osteoclasti. Poiché i macrofagi mononucleati (cellule RAW264.7) sono troppo costosi da acquistare e si attivano facilmente durante la coltura, è difficile eseguire esperimenti di differenziazione in vitro utilizzando questa linea cellulare. Sebbe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang (sovvenzione n. LY19H060001) e il Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (n. 2022ZB093).
Materials
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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