이차 부착 방법에 의한 쥐 뼈로부터 단핵구-대식세포 계통 세포의 분리
Summary
여기서 우리는 보조 순응 방법이라고 불리는 SD 쥐로부터 BMM을 분리하기위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
뼈 미네랄 밀도가 감소하면 뼈가 골절 될 가능성이 높아 환자의 삶의 질에 부정적인 영향을 미칩니다. 뼈의 성장과 발달은 주로 조골 세포와 파골 세포에 의해 조절됩니다. 파골세포는 골수 단핵구-대식세포(BMMs)로부터 유래된다는 것이 널리 받아들여지고 있다. BMM 및 기타 조혈 줄기 세포는 골수 공동에 위치한다. 따라서, 상이한 이종 및 이종 세포 집단으로부터 단일 안정한 BMM을 단리하는 것은 큰 도전이다. 여기서 우리는 보조 순응 방법이라고 불리는 SD 쥐로부터 BMM을 분리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 일차 배양에서 24-48 h 동안 배양된 부착성 세포를 수집하였다. 유세포 분석 결과 세포의 약 37.94%가 CD11b/c+(단핵구-대식세포 표면 항원)인 것으로 나타났다. 타르트레이트 내성 산 포스파타제(TRAP) 염색 및 웨스턴 블롯 분석은 BMM이 시험관 내에서 파골세포로 분화될 수 있음을 입증하였다. 위의 발견은 이차 부착 세포가 파골세포 분화 연구에 적합한 세포 모델로 간주 될 수 있음을 시사했다.
Introduction
골수에 존재하는 단핵구-대식세포 혈통세포는 혈액 단핵구 및 조직 대식세포 1,2로 분화할 수 있다고 보고되었다. 뼈의 성장과 발달의 균형을 맞추기 위해 파골세포로 분화할 수 있는 상기 세포들은 일반적으로 생체내 파골세포를 유도하기 위한 세포 모델로서 사용된다3,4. 골수는 골수 중간엽 줄기 세포, 골수 단핵구 – 대식 세포 (BMMs), 조혈 줄기 세포, 내피 세포 및 면역 세포를 포함하지만 이에 국한되지 않는 여러 가지 유형의 세포를 포함하는 특수 조직입니다. 사실, 이전의 여러 연구에 따르면 긴 뼈의 골수강에서 밀려난 부착 세포는 조골 세포, 파골세포, 연 골 세포 또는 지방세포 5,6,7,8로 분화 될 수 있다고 제안했습니다. 상이한 동질적인 세포 집단을 생산하기 위해 상이한 분리 및 배양 방법이 사용되었지만, 다양한 상이한 세포 유형으로부터 BMM을 단리하고 배양하는데 여전히 큰 도전이 있다.
골수 단핵 대식세포 (BMSCs)를 추출하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 그러나 이러한 방법의 대부분은 복잡한 9,10,11입니다. 예를 들어, 밀도 구배 원심분리에는 특수 키트가 필요하며 작업은 시간이 많이 걸리고 번거롭다. 이 방법은 대량 혈액 샘플에서 BMM을 분리하는 데 적합하지만 골수 샘플 9,12,13에서는 그렇지 않습니다. 또한, 콜라게나제 소화를 사용하여 조직 샘플을 추출하는 것은 복잡하고 시간이 많이 걸리는 절차입니다. 이 방법은 골수 샘플14,15에서 BMM을 분리하는 데 권장되지 않습니다. 또한, 유동 분리는 고도로 정제된 단핵구/대식세포 집단을 초래할 수 있지만, 매우 큰 표본 크기와 높은 장비 및 장비 요구 사항10,16을 필요로 한다. 추가적으로, 마이크로비드 농축 방법은 매우 비싸고, 일반 실험실(17)에서 실현가능하지 않다.
따라서, 현재의 연구에서는 골수로부터 단핵 대식세포를 분리하기 위해 편리하고, 빠르고, 값싼 방법이 제안되었다. 상이한 시점 동안 부착된 골수 세포는 이차 부착 방법을 사용하여 BMMs를 분리하는데 사용되었다. 상기 방법으로 추출된 BMM은 시험관내에서 파골세포의 형성을 유도할 수 있었고, 따라서 시험 관내에서 골다공증에 대한 미래의 연구를 위한 간단하고 편리한 세포 모델을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
파골세포는 골 질환의 발생 및 발달에 관여하는 가장 중요한 세포 유형 중 하나이며, 골 질환 연구20의 주요 목적 중 하나입니다. 단핵구 / 대식세포는 파골세포로 분화 될 수 있습니다. 단핵 대식세포(RAW264.7 세포)는 구입하기에 너무 비싸고 배양 중에 쉽게 활성화되기 때문에, 이 세포주를 이용한 시험관내 분화 실험을 수행하는 것은 어렵다. 골수에서 단핵구/대식세포를 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 절강 성의 자연 과학 재단 (보조금 없음)의 지원을 받았다. LY19H060001) 및 절강 전통 중국 의학 과학 기술 계획 프로젝트 (no. 2022ZB093).
Materials
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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