Isolering av monocytt-makrofag av slektslinjer fra rottebein ved sekundær tilslutningsmetode
Summary
Her presenterer vi en protokoll for isolering av BMMer fra SD-rotter, kalt sekundær tilslutningsmetode.
Abstract
Med en reduksjon av benmineraltetthet er bein mer sannsynlig å sprekke, og påvirker dermed pasientens livskvalitet negativt. Veksten og utviklingen av bein er hovedsakelig regulert av osteoblaster og osteoklaster. Det har blitt allment akseptert at osteoklaster er avledet fra benmarg monocytt-makrofagceller (BMMer). BMMer og andre hematopoietiske stamceller ligger i benmargshulen. Derfor er det en stor utfordring å isolere enkeltstabile BMMer fra forskjellige og heterogene cellepopulasjoner. Her presenterer vi en protokoll for isolering av BMMer fra SD-rotter, kalt sekundær tilslutningsmetode. Tilhengere celler dyrket i 24-48 timer i primærkulturen ble samlet inn. Strømningscytometrisk analyse viste at omtrent 37,94% av cellene var CD11b/c+ (monocytt-makrofag overflateantigen). Tartratresistent syrefosfatase (TRAP) farging og vestlig blot analyse viste at BMMer kunne skille seg ut i osteoklaster in vitro. Ovennevnte funn antydet at sekundære tilslutningsceller kunne betraktes som en egnet cellulær modell for osteoklastdifferensieringsforskning.
Introduction
Det har blitt rapportert at monocytt-makrofag avledningsceller som finnes i benmargen kan skille seg ut i blodmonocytter og vevsmakrofager 1,2. Ovennevnte celler, som kan skille seg ut i osteoklaster for å balansere beinvekst og utvikling, brukes ofte som en cellemodell for å indusere osteoklaster i vivo 3,4. Benmarg er et spesielt vev som inneholder flere forskjellige typer celler, som inkluderer, men ikke bare er begrenset til benmarg mesenchymale stamceller, benmarg monocytt-makrofagceller (BMMs), hematopoietiske stamceller, endotelceller og immunceller. Faktisk antydet flere tidligere studier at tilhengerceller rushed ut av benmargshulen i det lange beinet kunne skille seg ut i osteoblaster, osteoklaster, kondrocytter eller adipocytter 5,6,7,8. Selv om ulike isolasjons- og kulturmetoder har blitt brukt til å produsere forskjellige homogene cellepopulasjoner, er det fortsatt store utfordringer med å isolere og dyrke BMMer fra en rekke forskjellige celletyper.
Flere metoder er utviklet for å trekke ut benmarg mononukleære makrofager (BMSCer). Imidlertid er flertallet av disse metodene komplekse 9,10,11. For eksempel krever tetthet gradient sentrifugering et spesialisert sett, og operasjonen er tidkrevende og tungvint. Denne metoden er egnet for isolering av BMMer fra blodprøver med høyt volum, men ikke fra benmargsprøver 9,12,13. I tillegg er utvinning av vevsprøver ved hjelp av kollagenal fordøyelse en kompleks og tidkrevende prosedyre; Denne metoden anbefales ikke for isolering av BMMer fra benmargsprøver14,15. I tillegg, selv om strømningsseparasjon kan resultere i svært rensede monocytt/makrofagpopulasjoner, krever det svært store utvalgsstørrelser og høye instrument- og utstyrskrav10,16. I tillegg er mikrobeadberikelsesmetoden ekstremt dyr og er ikke mulig i et generelt laboratorium17.
Derfor ble det i den nåværende studien foreslått en praktisk, rask og billig metode for isolering av mononukleære makrofager fra benmargen. Benmargceller som fulgte for forskjellige tidspunkter, ble brukt til å isolere BMMer ved hjelp av en sekundær tilslutningsmetode. BMMs ekstrahert med ovennevnte metode kan indusere dannelsen av osteoklaster in vitro, og dermed gi en enkel og praktisk cellemodell for fremtidig studie av osteoporose in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoklaster er en av de viktigste celletypene som er involvert i forekomst og utvikling av beinsykdommer, samt en av de primære gjenstandene for beinsykdomsforskning20. Monocytt/makrofager kan skille seg ut i osteoklaster. Siden mononukleære makrofager (RAW264.7-celler) er for dyre å kjøpe og lett aktiveres under kultur, er det vanskelig å utføre in vitro differensieringsforsøk ved hjelp av denne cellelinjen. Selv om det er utviklet flere metoder for å trekke ut monocytter/makrof…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (tilskuddsnr. LY19H060001) og Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (nr. 2022ZB093).
Materials
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
References
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
- Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
- Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
- Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
- Horowitz, M. C., et al. marrow adipocytes. Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).
- Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
- Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
- Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
- Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657 (2020).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759 (2008).
- Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550 (2019).
- Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
- Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).
