Isolamento das células de linhagem monócito-macrófago dos ossos de ratos por método de adesão secundário
Summary
Aqui apresentamos um protocolo para o isolamento de BMMs de ratos SD, chamado de método de adesão secundária.
Abstract
Com uma diminuição da densidade mineral óssea, os ossos são mais propensos a fraturar, afetando negativamente a qualidade de vida do paciente. O crescimento e o desenvolvimento dos ossos são regulados principalmente por osteoblastos e osteoclartos. Tem sido amplamente aceito que os osteoclatos são derivados de células monócito-macrófagos de medula óssea (MMC). BMMs e outras células-tronco hematopoiéticas estão localizados na cavidade da medula óssea. Portanto, isolar BMs estáveis de diferentes populações de células heterogêneas é um grande desafio. Aqui apresentamos um protocolo para o isolamento de BMMs de ratos SD, chamado de método de adesão secundária. Foram coletadas células aderentes cultivadas por 24-48 h na cultura primária. A análise citométrica de fluxo mostrou que aproximadamente 37,94% das células eram CD11b/c+ (antígeno da superfície monocito-macrófago). A coloração de fosfattase de ácido resistente ao tartarato (TRAP) e a análise da mancha ocidental demonstraram que os BMMs poderiam se diferenciar em osteoclartos in vitro. Os achados acima sugeriram que as células de adesão secundárias poderiam ser consideradas como um modelo celular adequado para a pesquisa de diferenciação de osteoclatos.
Introduction
Foi relatado que as células de linhagem monocito-macrófago existentes na medula óssea podem se diferenciar em monócitos sanguíneos e macrófagosteciduais 1,2. As células acima, que podem se diferenciar em osteoclastas para equilibrar o crescimento e o desenvolvimento ósseo, são comumente utilizadas como modelo celular para induzir osteos in vivo 3,4. A medula óssea é um tecido especial que contém vários tipos diferentes de células, que incluem, mas não se limitam apenas a células-tronco mesenquimais de medula óssea, células monócito-macrófagos de medula óssea (MMMs), células-tronco hematopoiéticas, células endoteliais e células imunes. De fato, vários estudos anteriores sugeriram que as células aderentes que saíram correndo da cavidade da medula óssea do osso longo poderiam se diferenciar em osteoblastos, osteoclatos, condrócitos ou adipócitos 5,6,7,8. Embora diferentes métodos de isolamento e cultura tenham sido usados para produzir diferentes populações celulares homogêneas, ainda há grandes desafios em isolar e cultivar BMMs de uma variedade de tipos de células diferentes.
Vários métodos foram desenvolvidos para extrair macrófagos mononucleares de medula óssea (BMSCs). No entanto, a maioria desses métodos são complexos 9,10,11. Por exemplo, a centrifugação de gradiente de densidade requer um kit especializado e a operação é demorada e complicada. Este método é adequado para o isolamento de BMMs de amostras de sangue de alto volume, mas não a partir de amostras de medula óssea 9,12,13. Além disso, extrair amostras de tecido usando digestão de colagem é um procedimento complexo e demorado; este método não é recomendado para o isolamento de BMMs a partir de amostras de medula óssea14,15. Além disso, embora a separação do fluxo possa resultar em populações de monócitos/macrófagos altamente purificados, requer tamanhos amostrais muito grandes e requisitos elevados de instrumentos e equipamentos10,16. Além disso, o método de enriquecimento de microesferas é extremamente caro e não é viável em um laboratório geral17.
Portanto, no presente estudo foi proposto um método conveniente, rápido e barato para o isolamento de macrófagos mononucleares da medula óssea. As células de medula óssea aderidas para diferentes pontos de tempo foram utilizadas para isolar os BMMs utilizando um método secundário de adesão. Os BMMs extraídos com o método acima poderiam induzir a formação de osteoclatos in vitro, fornecendo assim um modelo celular simples e conveniente para o estudo futuro da osteoporose in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os osteoclatos são um dos tipos celulares mais significativos envolvidos na ocorrência e desenvolvimento de doenças ósseas, bem como um dos principais objetos da pesquisa dedoenças ósseas 20. Monócitos/macrófagos podem se diferenciar em osteoclatos. Como os macrófagos mononucleares (células RAW264.7) são muito caros para comprar e são facilmente ativados durante a cultura, é difícil realizar experimentos de diferenciação in vitro usando esta linha celular. Embora vários m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural da Província de Zhejiang (não conceder. LY19H060001) e o Projeto de Plano de Ciência e Tecnologia da Medicina Tradicional Chinesa de Zhejiang (nº 2022ZB093).
Materials
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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