Isolering av monocyt-makrofaglinjeceller från råttben med sekundär vidhäftningsmetod
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för isolering av BMM från SD-råttor, kallad sekundär vidhäftningsmetod.
Abstract
Med en minskning av benmineraltätheten är ben mer benägna att spricka, vilket påverkar patientens livskvalitet negativt. Tillväxten och utvecklingen av ben regleras huvudsakligen av osteoblaster och osteoklaster. Det har varit allmänt accepterat att osteoklaster härrör från benmärgsmonocyt-makrofagceller (BMM). BMM och andra hematopoetiska stamceller finns i benmärgshålan. Därför är det en enorm utmaning att isolera enstaka stabila BMM från olika och heterogena cellpopulationer. Här presenterar vi ett protokoll för isolering av BMM från SD-råttor, kallad sekundär vidhäftningsmetod. Vidhäftande celler odlade i 24-48 h i primärkulturen samlades in. Flödescytometrisk analys visade att cirka 37,94% av cellerna var CD11b / c + (monocyt-makrofagytantigen). Tartratresistent syrafosfatas (TRAP) färgning och western blot analys visade att BMM kunde differentiera till osteoklaster in vitro. Ovanstående resultat föreslog att de sekundära följsamhetscellerna kunde betraktas som en lämplig cellulär modell för osteoklastdifferentieringsforskning.
Introduction
Det har rapporterats att monocyt-makrofag-härstamningsceller som finns i benmärgen kan differentiera till blodmonocyter och vävnadsmakrofager 1,2. Ovanstående celler, som kan differentieras till osteoklaster för att balansera bentillväxt och utveckling, används ofta som en cellmodell för att inducera osteoklaster in vivo 3,4. Benmärg är en speciell vävnad som innehåller flera olika typer av celler, som inkluderar men inte bara är begränsade till benmärgsmesenkymala stamceller, benmärgsmonocyt-makrofagceller (BMM), hematopoetiska stamceller, endotelceller och immunceller. Faktum är att flera tidigare studier föreslog att vidhäftande celler som rusade ut ur benmärgshålan i det långa benet kunde differentieras till osteoblaster, osteoklaster, kondrocyter eller adipocyter 5,6,7,8. Även om olika isolerings- och odlingsmetoder har använts för att producera olika homogena cellpopulationer, finns det fortfarande stora utmaningar med att isolera och odla BMM från en mängd olika celltyper.
Flera metoder har utvecklats för att extrahera benmärgsmononukleära makrofager (BMSC). Majoriteten av dessa metoder är dock komplexa 9,10,11. Till exempel kräver densitetsgradientcentrifugering ett specialiserat kit och operationen är tidskrävande och besvärlig. Denna metod är lämplig för isolering av BMM från blodprover med hög volym, men inte från benmärgsprover 9,12,13. Dessutom är extraktion av vävnadsprover med användning av kollagenasuppslutning ett komplext och tidskrävande förfarande; Denna metod rekommenderas inte för isolering av BMM från benmärgsprover14,15. Dessutom, även om flödesseparation kan resultera i högrenade monocyt- / makrofagpopulationer, kräver det mycket stora provstorlekar och höga instrument- och utrustningskrav10,16. Dessutom är mikroberikningsmetoden extremt dyr och är inte genomförbar i ett allmänt laboratorium17.
Därför föreslogs i den aktuella studien en bekväm, snabb och billig metod för isolering av mononukleära makrofager från benmärgen. Benmärgsceller vidhäftade under olika tidpunkter användes för att isolera BMM med hjälp av en sekundär vidhäftningsmetod. BMM extraherade med ovanstående metod kan inducera bildandet av osteoklaster in vitro, vilket ger en enkel och bekväm cellmodell för framtida studier av osteoporos in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoklaster är en av de viktigaste celltyperna som är involverade i förekomst och utveckling av bensjukdomar, liksom ett av de primära föremålen för bensjukdomsforskning20. Monocyt/makrofager kan differentieras till osteoklaster. Eftersom mononukleära makrofager (RAW264.7-celler) är för dyra att köpa och lätt aktiveras under odling är det svårt att utföra in vitro-differentieringsexperiment med denna cellinje. Även om flera metoder har utvecklats för att extrahera monocy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (bidrag nr. LY19H060001) och Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (nr 2022ZB093).
Materials
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
References
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
- Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
- Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
- Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
- Horowitz, M. C., et al. marrow adipocytes. Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).
- Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
- Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
- Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
- Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657 (2020).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759 (2008).
- Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550 (2019).
- Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
- Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).
