कृंतक मायोसाइट्स में कार्डियक सिकुड़ा हुआ डिसफंक्शन और सीए2 + ट्रांसिएंट्स का विश्लेषण
Summary
प्रोटोकॉल का एक सेट प्रस्तुत किया जाता है जो पृथक चूहे मायोसाइट्स में कैल्शियम (सीए2+) क्षणिक माप के साथ-साथ सरकोमेरे लंबाई का पता लगाने के माध्यम से सिकुड़ा हुआ कार्य के माप का वर्णन करता है। दिल की विफलता के पशु मॉडल में अध्ययन के लिए इस दृष्टिकोण का अनुप्रयोग भी शामिल है।
Abstract
संकुचनशील शिथिलता और सीए2 + क्षणिक ों का अक्सर हृदय-प्रेरित चोट और / या रीमॉडेलिंग के व्यापक मूल्यांकन के हिस्से के रूप में सेलुलर स्तर पर विश्लेषण किया जाता है। इन कार्यात्मक परिवर्तनों का आकलन करने के लिए एक दृष्टिकोण प्राथमिक वयस्क कार्डियक मायोसाइट्स में अनलोडेड शॉर्टनिंग और सीए2 + क्षणिक विश्लेषण का उपयोग करता है। इस दृष्टिकोण के लिए, वयस्क मायोसाइट्स को कोलेजनेज पाचन द्वारा अलग किया जाता है, सीए2 + सहिष्णु बनाया जाता है, और फिर सीरम-मुक्त मीडिया में विद्युत पेसिंग के बाद लैमिनिन-लेपित कवरलिप्स का पालन किया जाता है। सामान्य प्रोटोकॉल वयस्क चूहे कार्डियक मायोसाइट्स का उपयोग करता है लेकिन अन्य प्रजातियों से प्राथमिक मायोसाइट्स के लिए आसानी से समायोजित किया जा सकता है। घायल दिलों से मायोसाइट्स में कार्यात्मक परिवर्तन की तुलना शाम मायोसाइट्स और / या इन विट्रो चिकित्सीय उपचारों से की जा सकती है। कार्यप्रणाली में सेल चैंबर और प्लेटफॉर्म घटकों के साथ मायोसाइट पेसिंग के लिए आवश्यक आवश्यक तत्व शामिल हैं। इस दृष्टिकोण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल में सरकोमेरे लंबाई का पता लगाने और सेलुलर सीए2 + ट्रांसिएंट्स द्वारा अनलोडेड शॉर्टिंग को मापने के लिए चरणों को शामिल किया गया है, जिसे अनुपातमीट्रिक संकेतक फुरा -2 एएम के साथ मापा जाता है, साथ ही साथ कच्चे डेटा विश्लेषण के लिए भी।
Introduction
कार्डियक पंप फ़ंक्शन के विश्लेषण के लिए अक्सर पर्याप्त अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए कई दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है, खासकर दिल की विफलता (एचएफ) के पशु मॉडल के लिए। इकोकार्डियोग्राफी या हेमोडायनामिक माप विवो कार्डियक डिसफंक्शन1 में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जबकि इन विट्रो दृष्टिकोण अक्सर यह पहचानने के लिए नियोजित किए जाते हैं कि क्या शिथिलता मायोफिलामेंट और / या सीए2 + क्षणिक में परिवर्तन से उत्पन्न होती है जो युग्मन उत्तेजना के लिए जिम्मेदार है, या संकुचन फ़ंक्शन (जैसे, उत्तेजना-संकुचन [ई-सी] युग्मन) के साथ कार्रवाई क्षमता। इन विट्रो दृष्टिकोण विवो उपचार रणनीतियों में महंगे और / या श्रमसाध्य का पीछा करने से पहले न्यूरोहार्मोन, वेक्टर-प्रेरित आनुवंशिक परिवर्तनों के साथ-साथ संभावित चिकित्सीयएजेंटों के लिए कार्यात्मक प्रतिक्रिया को स्क्रीन करने का अवसर भी प्रदान करते हैं।
इन विट्रो सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन की जांच करने के लिए कई दृष्टिकोण उपलब्ध हैं, जिसमें बरकरार ट्रेबेक्यूले3 या परमेबिलाइज्ड मायोसाइट्स4 में बल माप शामिल हैं, साथ ही एचएफ 5,6 की उपस्थिति और अनुपस्थिति में बरकरार मायोसाइट्स में अनलोडेड शॉर्टनिंग और सीए2 + ट्रांसिएंट्स शामिल हैं। इनमें से प्रत्येक दृष्टिकोण कार्डियक मायोसाइट सिकुड़ा हुआ कार्य पर केंद्रित है, जो कार्डियक पंप फ़ंक्शन 2,7 के लिए सीधे जिम्मेदार है। हालांकि, संकुचन और ई-सी युग्मन दोनों का विश्लेषण अक्सर मांसपेशियों की लंबाई को छोटा करके और अलग,सीए2 + सहिष्णु वयस्क मायोसाइट्स में सीए2 + क्षणिक को मापकर किया जाता है। प्रयोगशाला इस चरण 8 के लिए चूहे के दिल से मायोसाइट्स को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रकाशित प्रोटोकॉल का उपयोग करतीहै।
सीए2 + क्षणिक और मायोफिलामेंट्स दोनों बरकरार मायोसाइट्स में छोटे और फिर से लंबे होने में योगदान करते हैं और सिकुड़ा हुआ शिथिलता 2,7 में योगदान कर सकते हैं। इस प्रकार, इस दृष्टिकोण की सिफारिश की जाती है जब इन विट्रो कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सीए2 + साइकिलिंग मशीनरी और मायोफिलामेंट्स युक्त एक बरकरार मायोसाइट की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, जीन ट्रांसफर9 के माध्यम से मायोफिलामेंट या सीए2 + साइक्लिंग फ़ंक्शन को संशोधित करने के बाद सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए बरकरार पृथक मायोसाइट्स वांछनीय हैं। इसके अलावा, डाउनस्ट्रीम सेकंड मैसेंजर सिग्नलिंग मार्गों और / या चिकित्सीय एजेंटों की प्रतिक्रिया के प्रभाव का अध्ययन करते समय न्यूरोहार्मोन के कार्यात्मक प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक बरकरार मायोसाइट दृष्टिकोण का सुझाव दियाजाता है। एकल मायोसाइट्स में लोड-निर्भर बल का एक वैकल्पिक माप अक्सर कम तापमान (≤15 डिग्री सेल्सियस) पर झिल्ली परमेबिलाइजेशन (या खाल) के बाद किया जाता है ताकि सीए2 + क्षणिक योगदान को दूर किया जा सके और मायोफिलामेंट फ़ंक्शन10 पर ध्यान केंद्रित किया जा सके। बरकरार मायोसाइट्स में लोड-निर्भर बल प्लस सीए2 + ट्रांसिएंट्स का माप काफी हद तक दृष्टिकोण11 की जटिल और तकनीकी चुनौती के कारण दुर्लभ है, खासकर जब उच्च थ्रूपुट की आवश्यकता होती है, जैसे कि न्यूरोहार्मोन सिग्नलिंग के लिए प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए या चिकित्सीय एजेंटों के लिए स्क्रीन के रूप में। कार्डियक ट्रेबेक्यूले का विश्लेषण इन तकनीकी चुनौतियों को दूर करता है लेकिन गैर-मायोसाइट्स, फाइब्रोसिस और / या बाह्य मैट्रिक्स रीमॉडेलिंग 2 से भी प्रभावित हो सकताहै। ऊपर वर्णित प्रत्येक दृष्टिकोण के लिए वयस्क मायोसाइट्स युक्त तैयारी की आवश्यकता होती है क्योंकि इंड्यूसेबल प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से प्राप्त नवजात मायोसाइट्स और मायोसाइट्स अभी तक वयस्क मायोफिलामेंट प्रोटीन के पूर्ण पूरक को व्यक्त नहीं करते हैं और आमतौर पर वयस्क रॉड के आकार के मायोसाइट्स2 में मौजूद मायोफिलामेंट संगठन के स्तर की कमी होती है। आज तक, आईपीएससी में साक्ष्य इंगित करता है कि वयस्क आइसोफॉर्म में पूर्ण संक्रमण संस्कृति12 में 134 दिनों से अधिक है।
एचएफ पर इस संग्रह के फोकस को देखते हुए, प्रोटोकॉल में असफल बनाम गैर-असफल बरकरार मायोसाइट्स में सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन अलग करने के लिए दृष्टिकोण और विश्लेषण शामिल हैं। 5,13 से पहले वर्णित सुप्रा-रीनल कोआर्केशन के 18-20 सप्ताह बाद अध्ययन किए गए चूहे के मायोसाइट्स से प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान किए जाते हैं। फिर शाम-उपचारित चूहों से मायोसाइट्स की तुलना की जाती है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल और इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग एचएफ के विकास के दौरान रॉड के आकार के कार्डियक मायोसाइट्स में शॉर्टिंग और सीए2 + ट्रांसिएंट्स में परिवर्तन का विश्लेषण और निगरानी करने के लिए किया जाता है। इस विश्लेषण के लिए, 2 x 104 Ca2+-सहिष्णु, रॉड के आकार के मायोसाइट्स को 22 मिमी2 लैमिनिन-लेपित ग्लास कवरलिप्स (CS) पर चढ़ाया जाता है और रात भर सुसंस्कृत किया जाता है, जैसा कि पहलेवर्णित है। इष्टतम इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया और बफर के साथ इस इमेजिंग प्लेटफॉर्म के लिए इकट्ठे किए गए घटक सामग्री की तालिका में प्रदान किए जाते हैं। एक सॉफ्टवेयर और प्रतिनिधि परिणामों का उपयोग करके डेटा विश्लेषण के लिए एक गाइड भी यहां प्रदान किया गया है। समग्र प्रोटोकॉल को अलग-अलग उप-वर्गों में विभाजित किया गया है, जिसमें पहले तीन खंड पृथक चूहे मायोसाइट्स और डेटा विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करते हैं, इसके बाद सेलुलर सीए2 + क्षणिक प्रयोग और मायोसाइट्स में डेटा विश्लेषण होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
चरण 1 में उल्लिखित क्रोनिक पेसिंग प्रोटोकॉल पृथक मायोसाइट्स का अध्ययन करने और लंबे समय तक उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोगी समय बढ़ाता है। हमारी प्रयोगशाला में, क्रोनिक रूप से विकसित मायोसाइट…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान आर01 एचएल 144777 (एमवीडब्ल्यू) द्वारा समर्थित है।
Materials
| MEDIA | |||
| Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
| Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
| REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
| MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
| #1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
| 37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
| Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
| Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
| Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
| Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
| CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
| Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
| Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
| Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
| Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
| Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
| Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
| Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
| small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
| Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
| Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
| Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |
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