فحص Gravitaxis على نطاق واسع من يرقات Caenorhabditis Dauer
Summary
يحدد هذا البروتوكول طرق إجراء فحص محور الجاذبية على نطاق واسع باستخدام يرقات Caenorhabditis dauer. يسمح هذا البروتوكول بالكشف بشكل أفضل عن سلوك محور الجاذبية مقارنة بالفحص القائم على اللوحة.
Abstract
الإحساس بالجاذبية هو عملية مهمة وغير مدروسة نسبيا. استشعار الجاذبية يمكن الحيوانات من التنقل في محيطها ويسهل الحركة. بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط الإحساس بالجاذبية ، الذي يحدث في الأذن الداخلية للثدييات ، ارتباطا وثيقا بالسمع – وبالتالي ، فإن فهم هذه العملية له آثار على الأبحاث السمعية والدهليزية. توجد اختبارات Gravitaxis لبعض الكائنات الحية النموذجية ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة. تم فحص الديدان المفردة سابقا لتفضيل اتجاهها أثناء استقرارها في المحلول. ومع ذلك ، لم يتم وصف فحص موثوق وقوي لمحور الجاذبية Caenorhabditis . يحدد هذا البروتوكول إجراء لإجراء مقايسات محور الجاذبية التي يمكن استخدامها لاختبار المئات من كاورات Caenorhabditis في وقت واحد. يسمح هذا الفحص الواسع النطاق لمسافات طويلة بجمع بيانات مفصلة ، والكشف عن الأنماط الظاهرية التي قد يتم تفويتها في الفحص القياسي القائم على اللوحة. تتم مقارنة حركة داور على طول المحور الرأسي مع عناصر التحكم الأفقية لضمان أن التحيز الاتجاهي يرجع إلى الجاذبية. يمكن بعد ذلك مقارنة تفضيل الجاذبية بين السلالات أو الظروف التجريبية. يمكن لهذه الطريقة تحديد المتطلبات الجزيئية والخلوية والبيئية لمحور الجاذبية في الديدان.
Introduction
يعد استشعار جاذبية الأرض أمرا بالغ الأهمية لتوجيه العديد من الكائنات الحية وحركتها وتنسيقها وتوازنها. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية والدوائر العصبية للإحساس بالجاذبية غير مفهومة بشكل جيد مقارنة بالحواس الأخرى. في الحيوانات ، يتفاعل الإحساس بالجاذبية مع المحفزات الأخرى ويمكن التغلب عليها للتأثير على السلوك. يمكن دمج الإشارات البصرية وردود الفعل الحسية والمعلومات الدهليزية لتوليد شعور بالوعي بالجسم بالنسبة إلى محيط الحيوان 1,2. على العكس من ذلك ، يمكن تغيير تفضيل الجاذبية في وجود محفزات أخرى 3,4,5. لذلك ، يعد السلوك الثقالي مثاليا لدراسة الإحساس بالجاذبية وفهم التكامل الحسي المعقد للجهاز العصبي واتخاذ القرارات.
C. elegans هو كائن حي نموذجي مفيد بشكل خاص لدراسة محور الجاذبية بسبب دورة حياته متعددة الفينات. عند التعرض للضغوطات أثناء التطور ، بما في ذلك الحرارة أو الاكتظاظ أو نقص الطعام ، تتطور يرقات C. elegans إلى dauers ، وهي مقاومة للإجهاد للغاية6. تؤدي الديدان سلوكيات مميزة ، مثل النيكتيشن ، حيث “تقف” الديدان على ذيولها وتلوح برؤوسها ، والتي قد تسهل الانتشار إلى موائل أفضل7. تشير فحوصات Gravitaxis ل C. elegans و C. japonica إلى أن يرقات dauer تجاذب بشكل سلبي ، وأن هذا السلوك يتم ملاحظته بسهولة أكبر في dauers منه في البالغين 8,9. قد يكشف اختبار محور الجاذبية في سلالات التهاب Caenorhabditis الأخرى عن تباين طبيعي في السلوك الثقالي.
تم تمييز آليات الإحساس بالجاذبية في Euglena و Drosophila و Ciona وأنواع أخرى مختلفة باستخدام مقايسات الجاذبية3،10،11. وفي الوقت نفسه ، قدمت دراسات محور الجاذبية في Caenorhabditis في البداية نتائج مختلطة. وجدت دراسة للتفضيل التوجيهي C. elegans أن الديدان تتجه مع رؤوسها لأسفل في المحلول ، مما يشير إلى تفضيل إيجابي للجاذبية12. وفي الوقت نفسه ، على الرغم من أن C. japonica dauers تم تحديده في وقت مبكر على أنه سلبيالجاذبية 8 ، إلا أن هذا السلوك لم يتم وصفه إلا مؤخرا في C. elegans9. تنشأ العديد من التحديات في تطوير اختبار محور الجاذبية التمثيلي في الديدان. يتم الحفاظ على سلالات Caenorhabditis على لوحات أجار. لهذا السبب ، تستخدم الفحوصات السلوكية عادة لوحات أجار كجزء من تصميمها التجريبي13،14،15. تم إجراء أول فحص لمحور الجاذبية المبلغ عنه في Caenorhabditis عن طريق وضع لوحة على جانبها بزاوية 90 درجة إلى لوحة التحكم الأفقية8. ومع ذلك ، فإن سلوك محور الجاذبية ليس دائما قويا في ظل هذه الظروف. في حين يمكن فحص الديدان البالغة للتفضيل التوجيهي في الحل12 ، قد يكون هذا التفضيل الاتجاهي معتمدا أيضا على السياق ، مما يؤدي إلى سلوكيات مختلفة إذا كانت الديدان تزحف بدلا من السباحة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن C. elegans حساسة للمحفزات الأخرى ، بما في ذلك الضوء والمجالات الكهرومغناطيسية 16,17 ، والتي تتداخل مع استجاباتها للجاذبية9. لذلك ، فإن فحص محور الجاذبية المحدث الذي يحمي من المتغيرات البيئية الأخرى مهم لتشريح آليات هذه العملية الحسية.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف فحص لمراقبة Caenorhabditis gravitaxis. يعتمد الإعداد لهذه الدراسة جزئيا على طريقة تم تطويرها لدراسة السلامة العصبية العضلية18,19. يتم استزراع يرقات داور وعزلها باستخدام الإجراءات القياسية20. ثم يتم حقنها في غرف مصنوعة من ماصتين مصليتين سعة 5 مل مملوءتين بالأجار. يمكن توجيه هذه الغرف عموديا أو أفقيا ووضعها داخل قفص فاراداي مظلم لمدة 12-24 ساعة للحماية من الضوء والمجالات الكهرومغناطيسية. يتم تسجيل موقع كل دودة في الغرف ومقارنتها بسيارات الأجرة الرأسية لسلالة مرجعية مثل C. elegans N2.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقارنة مع الطرق السابقة
على عكس التاكسي الكيميائي ، لا يمكن ملاحظة محور الجاذبية في Caenorhabditis بشكل موثوق باستخدام تصميم تجريبي تقليدي للوحة أجار. يبلغ قطر طبق بتري القياسي 150 مم ، مما يؤدي إلى توفر 75 مم فقط في أي من الاتجاهين ل dauers لإظهار تفضيل محور الجاذبية. على الرغم من أنه ي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من خلال منح بحثية من المعاهد الوطنية للصحة إلى JHR (#R01 5R01HD081266 و #R01GM141493). تم توفير بعض السلالات من قبل CGC ، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية البحثية (P40 OD010440). نود أن نعرب عن تقديرنا لبراديب جوشي (UCSB) على مدخلاته التحريرية. استشارة إحصائية مقدمة من مختبر بيانات UCSB.
Materials
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media – 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
References
- Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
- Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
- Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
- Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
- Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
- Frézal, L., Félix, M. -. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
- Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
- Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
- Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
- Häder, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).
- Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston’s organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
- Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
- Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
- Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
- Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
- Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
- Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
- Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn’s test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
- Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. 유전학. 212 (1), 25-51 (2019).
- Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
- Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
- Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
- Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).
- Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
- Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
- Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
- Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
- Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
- Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
- Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).
