Ensayo de gravitaxis a gran escala de larvas de Caenorhabditis dauer
Summary
El presente protocolo describe métodos para realizar un ensayo gravitacional a gran escala con larvas de Caenorhabditis dauer. Este protocolo permite una mejor detección del comportamiento del eje gravitacional en comparación con un ensayo basado en placas.
Abstract
La sensación de gravedad es un proceso importante y relativamente poco estudiado. La detección de la gravedad permite a los animales navegar por su entorno y facilita el movimiento. Además, la sensación de gravedad, que ocurre en el oído interno de los mamíferos, está estrechamente relacionada con la audición, por lo tanto, comprender este proceso tiene implicaciones para la investigación auditiva y vestibular. Existen ensayos de gravitaxis para algunos organismos modelo, incluyendo Drosophila. Los gusanos individuales han sido previamente ensayados para determinar su preferencia de orientación a medida que se asientan en solución. Sin embargo, no se ha descrito un ensayo fiable y robusto para el eje gravititario de Caenorhabditis . El presente protocolo describe un procedimiento para realizar ensayos de eje gravitacional que se puede utilizar para probar cientos de dauers de Caenorhabditis a la vez. Este ensayo a gran escala y a larga distancia permite la recopilación detallada de datos, revelando fenotipos que pueden pasarse por alto en un ensayo estándar basado en placas. El movimiento de Dauer a lo largo del eje vertical se compara con los controles horizontales para garantizar que el sesgo direccional se deba a la gravedad. La preferencia gravitáctica se puede comparar entre cepas o condiciones experimentales. Este método puede determinar los requisitos moleculares, celulares y ambientales para el eje gravitacional en gusanos.
Introduction
Detectar la atracción gravitacional de la Tierra es crucial para la orientación, el movimiento, la coordinación y el equilibrio de muchos organismos. Sin embargo, los mecanismos moleculares y los neurocircuitos de la sensación de gravedad son poco conocidos en comparación con otros sentidos. En los animales, la sensación de gravedad interactúa y puede ser superada por otros estímulos para influir en el comportamiento. Las señales visuales, la retroalimentación propioceptiva y la información vestibular pueden integrarse para generar un sentido de conciencia corporal en relación con el entorno de un animal 1,2. Por el contrario, la preferencia gravíctica puede ser alterada en presencia de otros estímulos 3,4,5. Por lo tanto, el comportamiento gravitáctico es ideal para estudiar la sensación de gravedad y comprender la compleja integración sensorial del sistema nervioso y la toma de decisiones.
C. elegans es un organismo modelo especialmente útil para estudiar el eje gravitacional debido a su ciclo de vida polifénico. Cuando se exponen a factores estresantes durante el desarrollo, incluyendo calor, hacinamiento o falta de alimentos, las larvas de C. elegans se convierten en dauers, que son altamente resistentes al estrés6. Como dauers, los gusanos realizan comportamientos característicos, como la nictación, en la que los gusanos “se paran” sobre sus colas y agitan sus cabezas, lo que puede facilitar la dispersión a mejores hábitats7. Los ensayos de gravitaxis de C. elegans y C. japonica sugieren que las larvas de dauer gravitan negativamente, y que este comportamiento se observa más fácilmente en dauers que en adultos 8,9. Las pruebas del eje gravitacional en otras cepas de Caenorhabditis pueden revelar una variación natural en el comportamiento gravitáctico.
Los mecanismos para la sensación de gravedad se han caracterizado en Euglena, Drosophila, Ciona y varias otras especies utilizando ensayos de eje gravitacional 3,10,11. Mientras tanto, los estudios del eje gravitacional en Caenorhabditis inicialmente proporcionaron resultados mixtos. Un estudio de la preferencia orientacional de C. elegans encontró que los gusanos se orientan con la cabeza hacia abajo en solución, sugiriendo una preferencia gravitáctica positiva12. Mientras tanto, aunque los dauers de C. japonica fueron identificados desde el principio como gravitácticos negativos8, este comportamiento solo recientemente se ha descrito en C. elegans9. Varios desafíos surgen en el desarrollo de un ensayo de gravitaxis representativo en gusanos. Las cepas de Caenorhabditis se mantienen en placas de agar; Por esta razón, los ensayos de comportamiento suelen utilizar placas de agar como parte de su diseño experimental13,14,15. El primer ensayo de eje gravitacional reportado en Caenorhabditis se realizó colocando una placa de lado en un ángulo de 90 ° con respecto a la placa de control horizontal8. Sin embargo, el comportamiento del eje gravitacional no siempre es robusto en estas condiciones. Mientras que los gusanos adultos pueden ser ensayados para la preferencia orientativa en la solución12, esta preferencia direccional también puede depender del contexto, lo que lleva a diferentes comportamientos si los gusanos se arrastran en lugar de nadar. Además, C. elegans es sensible a otros estímulos, incluyendo la luz y los campos electromagnéticos16,17, que interfieren con sus respuestas a la gravedad9. Por lo tanto, un ensayo de eje gravitacional actualizado que protege contra otras variables ambientales es importante para diseccionar los mecanismos de este proceso sensorial.
En el presente protocolo, se describe un ensayo para observar el eje gravitacional de Caenorhabditis. La configuración para este estudio se basa en parte en un método desarrollado para estudiar la integridad neuromuscular18,19. Las larvas de Dauer se cultivan y aíslan utilizando procedimientos estándar20. Luego se inyectan en cámaras hechas de dos pipetas serológicas de 5 ml llenas de agar. Estas cámaras pueden orientarse vertical u horizontalmente y colocarse dentro de una jaula de Faraday oscura durante 12-24 h para protegerse contra la luz y los campos electromagnéticos. La ubicación de cada gusano en las cámaras se registra y se compara con los taxis verticales de una cepa de referencia como C. elegans N2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comparación con métodos anteriores
A diferencia de la quimiotaxis, el eje gravitacional en Caenorhabditis no se puede observar de manera confiable utilizando un diseño experimental tradicional de placa de agar. Una placa de Petri estándar tiene 150 mm de diámetro, lo que resulta en solo 75 mm disponibles en cualquier dirección para que los dauers demuestren la preferencia del eje gravitatorio. Aunque la preferencia orientativa de C. elegans se puede ensayar en la solución<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud a JHR (#R01 5R01HD081266 y #R01GM141493). Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Nos gustaría agradecer a Pradeep Joshi (UCSB) por su aporte editorial. Consulta estadística proporcionada por el DATALAB de UCSB.
Materials
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media – 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
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