Storskalig gravitaxanalys av Caenorhabditis Dauer larver

Summary

Detta protokoll beskriver metoder för att genomföra en storskalig gravitaxisanalys med Caenorhabditis dauer larver. Detta protokoll möjliggör bättre detektion av gravitaxis beteende jämfört med en plattbaserad analys.

Abstract

Gravitationssensation är en viktig och relativt understuderad process. Att känna av gravitationen gör det möjligt för djur att navigera i sin omgivning och underlättar rörelse. Dessutom är tyngdkraftskänslan, som uppträder i däggdjurets inre öra, nära besläktad med hörseln – så att förstå denna process har konsekvenser för hörsel och vestibulär forskning. Gravitaxisanalyser finns för vissa modellorganismer, inklusive Drosophila. Enstaka maskar har tidigare analyserats för sin orienteringspreferens när de bosätter sig i lösning. En tillförlitlig och robust analys för Caenorhabditis gravitaxis har dock inte beskrivits. Det nuvarande protokollet beskriver ett förfarande för att utföra gravitaxisanalyser som kan användas för att testa hundratals Caenorhabditis dauers åt gången. Denna storskaliga, långdistansanalys möjliggör detaljerad datainsamling och avslöjar fenotyper som kan missas på en standardplattbaserad analys. Dauer-rörelse längs den vertikala axeln jämförs med horisontella kontroller för att säkerställa att riktningsförspänning beror på tyngdkraften. Gravitaktisk preferens kan sedan jämföras mellan stammar eller experimentella förhållanden. Denna metod kan bestämma molekylära, cellulära och miljömässiga krav för gravitaxis i maskar.

Introduction

Att känna av jordens gravitationskraft är avgörande för många organismers orientering, rörelse, koordination och balans. De molekylära mekanismerna och neurokretsarna för gravitationssensation är emellertid dåligt förstådda jämfört med andra sinnen. Hos djur interagerar gravitationskänslan med och kan konkurreras ut av andra stimuli för att påverka beteendet. Visuella ledtrådar, proprioceptiv feedback och vestibulär information kan integreras för att skapa en känsla av kroppsmedvetenhet i förhållande till ett djurs omgivning ^1,2. Omvänt kan gravitaktisk preferens ändras i närvaro av andra stimuli ^3,4,5. Därför är gravitaktiskt beteende idealiskt för att studera gravitationskänsla och förstå nervsystemets komplexa sensoriska integration och beslutsfattande.

C. elegans är en särskilt användbar modellorganism för att studera gravitaxis på grund av dess polyfeniska livscykel. När de utsätts för stressfaktorer under utveckling, inklusive värme, överbeläggning eller brist på mat, utvecklas C. elegans larver till dauers, som är mycket stressresistenta⁶. Som dauers utför maskar karakteristiska beteenden, såsom nictation, där maskar “står” på sina svansar och viftar med huvudet, vilket kan underlätta spridning till bättre livsmiljöer⁷. Gravitaxisanalyser av C. elegans och C. japonica tyder på att dauerlarver negativt gravitax, och att detta beteende lättare observeras hos dauers än hos vuxna ^8,9. Testning av gravitaxis i andra Caenorhabditis-stammar kan avslöja naturlig variation i gravitaktiskt beteende.

Mekanismer för gravitationskänsla har karakteriserats i Euglena, Drosophila, Ciona och olika andra arter med hjälp av gravitaxanalys 3,10,11. Samtidigt gav gravitaxisstudier i Caenorhabditis initialt blandade resultat. En studie av C. elegans orienteringspreferens fann att maskar orienterar med huvudet nedåt i lösning, vilket tyder på positiv gravitaktisk preferens¹². Under tiden, även om C. japonica dauers tidigt identifierades som negativt gravitaktiska⁸, har detta beteende först nyligen beskrivits i C. elegans⁹. Flera utmaningar uppstår vid utvecklingen av en representativ gravitaxisanalys i maskar. Caenorhabditis stammar upprätthålls på agarplattor; Av denna anledning använder beteendeanalyser vanligtvis agarplattor som en del av deras experimentella design^13,14,15. Den tidigaste rapporterade gravitaxisanalysen i Caenorhabditis utfördes genom att en platta stod på sidan i 90 ° vinkel mot den horisontella styrplattan⁸. Gravitaxis beteende är dock inte alltid robust under dessa förhållanden. Medan vuxna maskar kan analyseras för orienteringspreferens i lösning¹², kan denna riktningspreferens också vara kontextberoende, vilket leder till olika beteenden om maskarna kryper snarare än simmar. Dessutom är C. elegans känslig för andra stimuli, inklusive ljus och elektromagnetiska fält^16,17, som stör deras svar på tyngdkraften⁹. Därför är en uppdaterad gravitaxanalys som skyddar mot andra miljövariabler viktig för att dissekera mekanismerna i denna sensoriska process.

I detta protokoll beskrivs en analys för att observera Caenorhabditis gravitaxis. Upplägget för denna studie bygger delvis på en metod som utvecklats för att studera neuromuskulär integritet^18,19. Dauerlarver odlas och isoleras med hjälp av standardprocedurer²⁰. De injiceras sedan i kamrar gjorda av två 5 ml serologiska pipetter fyllda med agar. Dessa kamrar kan orienteras vertikalt eller horisontellt och placeras i en mörk Faraday-bur i 12-24 timmar för att skydda mot ljus och elektromagnetiska fält. Placeringen av varje mask i kamrarna registreras och jämförs med de vertikala taxibilarna för en referensstam som C. elegans N2.

Protocol

De stammar som används i denna studie är C. elegans (N2) och C. briggsae (AF16) (se materialförteckning). En blandad könspopulation av dauers användes för varje analys. 1. Förberedelse av kammaren Arbeta i en dragskåp. Ställ in arbetsytan med en Bunsen-brännare, 1-2 rakblad, tång, pincett och en plastskäryta (se Materialförteckning). För varje kammare, samla två 5 ml serologiska pipetter. Ta…

Representative Results

Jämförelse av gravitaxis mellan arterEfter det ovan beskrivna förfarandet kan C. briggsae dauer gravitaxis jämföras med C. elegans gravitaxis och horisontella kontroller. Den vertikala fördelningen (rödbrun) av C. briggsae dauers är snedställd mot kamrarnas toppar, med en stor andel maskar som når +7 (figur 2A). Kontrasterad med horisontella kontroller (aqua), där dauers fördelas i en ungefär klockformad kurva runt mitten av kamrar…

Discussion

Jämförelse med tidigare metoder
Till skillnad från kemotaxis kan gravitaxis i Caenorhabditis inte observeras på ett tillförlitligt sätt med hjälp av en traditionell experimentell design av agarplattor. En vanlig petriskål är 150 mm i diameter, vilket resulterar i endast 75 mm tillgängliga i båda riktningarna för dauers för att visa gravitaxispreferens. Även om C. elegans orienteringspreferens kan analyseras i lösning¹², är denna metod låg geno…

Materials

1% Sodium Dodecyl Sulfate solution			From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes	Falcon	14-959-53A
3 mm Hex key			Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L			Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes	Fisherbrand	S68228C	Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution			60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap	Fisherbrand	22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades	Fisherbrand	12-640
Faraday cage			Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers			Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape	Carolina	215620
M9 buffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50			1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film	Bemis	13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer	BTLab SYSTEMS	BT913	With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor	Corning	357469
Stereo Microscope	Laxco	S2103LS100
Tally counter	ULINE	H-7350
Thick NGM/agar plate media – 1 L			See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers