Inkoop en perfusie-decellularisatie van porcine gevasculariseerde flappen in een aangepaste perfusiebioreactor
Summary
Het protocol beschrijft de chirurgische verkrijging en daaropvolgende decellularisatie van gevasculariseerde varkensflappen door de perfusie van natriumdodecylsulfaatwater door de flapvasculatuur in een aangepaste perfusiebioreactor.
Abstract
Grote volumeke delen defecten leiden tot functionele tekorten en kunnen de kwaliteit van leven van de patiënt sterk beïnvloeden. Hoewel chirurgische reconstructie kan worden uitgevoerd met behulp van autologe vrije flaptransfer of gevasculariseerde composiet allotransplantatie (VCA), hebben dergelijke methoden ook nadelen. Problemen zoals morbiditeit op de donorplaats en de beschikbaarheid van weefsel beperken autologe vrije flaptransfer, terwijl immunosuppressie een significante beperking van VCA is. Gemanipuleerde weefsels in reconstructieve chirurgie met behulp van decellularisatie / recellularisatiemethoden vertegenwoordigen een mogelijke oplossing. Gedecellulariseerde weefsels worden gegenereerd met behulp van methoden die native cellulair materiaal verwijderen met behoud van de onderliggende extracellulaire matrix (ECM) microarchitectuur. Deze acellulaire steigers kunnen vervolgens worden gerecellulariseerd met ontvangerspecifieke cellen.
Dit protocol beschrijft de inkoop- en decellularisatiemethoden die worden gebruikt om acellulaire steigers in een varkensmodel te bereiken. Daarnaast geeft het ook een beschrijving van het ontwerp en de opstelling van de perfusiebioreactor. De flappen omvatten het varkensomentum, de tensor fascia lata en de radiale onderarm. Decellularisatie wordt uitgevoerd via ex vivo perfusie van natriumdodecylsulfaat (SDS) wasmiddel met lage concentratie, gevolgd door DNase-enzymbehandeling en perazijnzuursterilisatie in een aangepaste perfusiebioreactor.
Succesvolle weefseldecellularisatie wordt gekenmerkt door een wit-ondoorzichtig uiterlijk van flappen macroscopisch. Acellulaire flappen tonen de afwezigheid van kernen op histologische kleuring en een significante vermindering van het DNA-gehalte. Dit protocol kan efficiënt worden gebruikt om gedecellulariseerde weke delen steigers te genereren met geconserveerde ECM en vasculaire microarchitectuur. Dergelijke steigers kunnen worden gebruikt in latere recellularisatiestudies en hebben het potentieel voor klinische vertaling in reconstructieve chirurgie.
Introduction
Traumatisch letsel en tumorverwijdering kunnen leiden tot grote en complexe defecten van zacht weefsel. Deze defecten kunnen de kwaliteit van leven van de patiënt aantasten, functieverlies veroorzaken en leiden tot blijvende invaliditeit. Hoewel technieken zoals autologe weefselflapoverdracht vaak worden toegepast, zijn problemen met de beschikbaarheid van flappen en morbiditeit van de donorplaats belangrijke beperkingen 1,2,3. Gevasculariseerde composiet allotransplantatie (VCA) is een veelbelovend alternatief dat samengestelde weefsels, bijvoorbeeld spieren, huid, vasculatuur, als een enkele eenheid overdraagt aan ontvangers. VCA vereist echter langdurige immunosuppressie, wat leidt tot geneesmiddeltoxiciteit, opportunistische infecties en maligniteiten 4,5,6.
Tissue-engineered acellulaire steigers zijn een mogelijke oplossing voor deze beperkingen7. Acellulaire weefselsteigers kunnen worden verkregen met behulp van decellularisatiemethoden, die cellulair materiaal uit inheemse weefsels verwijderen met behoud van de onderliggende extracellulaire matrix (ECM) microarchitectuur. In tegenstelling tot het gebruik van synthetische materialen in tissue engineering, biedt het gebruik van biologisch afgeleide steigers een biomimetisch ECM-substraat dat biocompatibiliteit en het potentieel voor klinische vertaling mogelijk maakt8. Na decellularisatie kan de daaropvolgende recellularisatie van scaffolds met ontvangerspecifieke cellen vervolgens functionele, gevasculariseerde weefsels genereren met weinig tot geen immunogeniciteit 9,10,11. Door een effectief protocol te ontwikkelen om acellulaire weefsels te verkrijgen met behulp van perfusie-decellularisatietechnieken, kan een breed scala aan weefseltypen worden gemanipuleerd. Op zijn beurt maakt het voortbouwen op deze techniek de toepassing op complexere weefsels mogelijk. Tot op heden is perfusie-decellularisatie van gevasculariseerde zachte weefsels onderzocht met behulp van eenvoudige gevasculariseerde weefsels zoals een fasciocutane flap van volledige dikte bij knaagdier12, varkens13 en menselijke modellen14, evenals varkens rectus abdominis skeletspieren15. Bovendien zijn complexe gevasculariseerde weefsels ook perfusie gedecellulariseerd, zoals aangetoond in varkens- enmensenoormodellen 16,17 en menselijke full-face transplantaatmodellen18.
Hier beschrijft het protocol de decellularisatie van gevasculariseerde vrije flappen met behulp van biologisch afgeleide ECM-steigers. We presenteren de decellularisatie van drie klinisch relevante flappen: 1) het omentum, 2) de tensor fascia lata en 3) de radiale onderarm, die allemaal representatief zijn voor werkpaardflappen die routinematig worden gebruikt in reconstructieve chirurgie en niet eerder zijn onderzocht in dierstudies in de context van weefseldecellularisatie. Deze bio-technische flappen bieden een veelzijdig en direct beschikbaar platform dat het potentieel heeft voor klinische toepassingen voor gebruik op het gebied van reparatie en reconstructie van grote weke delendefecten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het voorgestelde protocol maakt gebruik van de perfusie van SDS met lage concentratie om een reeks van varkens afgeleide flappen te decellulariseren. Met deze procedure kunnen acellulair omentum, tensor fascia lata en radiale onderarmflappen met succes worden gedecellulariseerd met behulp van een protocol dat SDS met lage concentratie bevordert. Voorlopige optimalisatie-experimenten hebben vastgesteld dat SDS bij een lage concentratie (0,05%) tussen 2 dagen tot 5 dagen in staat is om cellulair materiaal voor het omentum,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen
Materials
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
- Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).
- Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
- Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
- Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering – Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
- Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).
- Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
- Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
- Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
- Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).
- Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
- Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).
- Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
- Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).
