맞춤형 관류 생물 반응기에서 돼지 혈관 플랩의 조달 및 관류-탈세포화
Summary
이 프로토콜은 맞춤형 관류 생물 반응기에서 플랩 혈관 구조를 통해 나트륨 도데 실 설페이트 세제의 관류에 의한 혈관 화 된 돼지 플랩의 외과 적 조달 및 후속 탈세포화를 설명합니다.
Abstract
대량의 연조직 결함은 기능적 결함을 유발하고 환자의 삶의 질에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 자가 자유 피판 이식 또는 혈관화 복합 동종 이식 (VCA)을 사용하여 외과 적 재건을 수행 할 수 있지만, 이러한 방법에는 단점도 있습니다. 기증자 부위 이환율 및 조직 가용성과 같은 문제는 자가 자유 피판 전달을 제한하는 반면, 면역억제는 VCA의 중요한 한계입니다. 탈세포화/재세포화 방법을 사용하는 재건 수술에서 조작된 조직은 가능한 해결책을 제시합니다. 탈세포화된 조직은 기본 세포외 기질(ECM) 마이크로아키텍처를 보존하면서 천연 세포 물질을 제거하는 방법을 사용하여 생성됩니다. 이어서, 이들 무세포 스캐폴드는 후속적으로 수용자-특이적 세포로 재세포화될 수 있다.
이 프로토콜은 돼지 모델에서 무세포 스캐폴드를 달성하는 데 사용되는 조달 및 탈세포화 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 관류 바이오리액터 설계 및 설정에 대한 설명도 제공한다. 플랩에는 돼지 omentum, 텐서 근막 라타 및 방사형 팔뚝이 포함됩니다. 탈세포화는 저농도 도데실 황산나트륨(SDS) 세제의 생체 외 관류에 이어 맞춤형 관류 바이오리액터에서 DNase 효소 처리 및 과초산 살균을 통해 수행됩니다.
성공적인 조직 탈세포화는 거시적으로 플랩의 흰색 불투명 외관을 특징으로 합니다. 무세포 플랩은 조직 학적 염색에 핵이없고 DNA 함량이 크게 감소함을 보여줍니다. 이 프로토콜은 보존된 ECM 및 혈관 마이크로아키텍처를 사용하여 탈세포화된 연조직 스캐폴드를 생성하는 데 효율적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 스캐폴드는 후속 재세포화 연구에 사용될 수 있으며 재건 수술에서 임상 번역의 잠재력을 가지고 있습니다.
Introduction
외상성 손상 및 종양 제거는 크고 복잡한 연조직 결함을 유발할 수 있습니다. 이러한 결함은 환자의 삶의 질을 손상시키고 기능 상실을 유발하며 영구적 인 장애를 초래할 수 있습니다. 자가 조직 플랩 이식과 같은 기술이 일반적으로 시행되었지만 플랩 가용성 및 기증자 부위 이환율 문제는 주요 제한 사항입니다 1,2,3. 혈관화 복합 동종 이식(VCA)은 복합 조직, 예를 들어 근육, 피부, 혈관계를 단일 단위로 수혜자에게 전달하는 유망한 대안입니다. 그러나 VCA는 약물 독성, 기회 감염 및 악성 종양 4,5,6을 유발하는 장기 면역 억제가 필요합니다.
조직 공학적 무세포 스캐폴드는 이러한 한계에 대한 잠재적인 해결책입니다7. 무세포 조직 스캐폴드는 기본 세포외 기질(ECM) 마이크로아키텍처를 보존하면서 천연 조직에서 세포 물질을 제거하는 탈세포화 방법을 사용하여 얻을 수 있습니다. 조직 공학에서 합성 물질을 사용하는 것과는 대조적으로, 생물학적으로 유래 된 스캐 폴드의 사용은 생체 적합성 및 임상 번역 가능성을 허용하는 생체 모방 ECM 기질을 제공한다8. 탈세포화 후, 수용자-특이적 세포를 갖는 스캐폴드의 후속 재세포화는 면역원성이 거의 또는 전혀 없는 기능적이고 혈관화된 조직을 생성할 수 있다 9,10,11. 관류 탈세포화 기술을 사용하여 무세포 조직을 얻기 위한 효과적인 프로토콜을 개발함으로써 광범위한 조직 유형을 설계할 수 있습니다. 차례로,이 기술을 기반으로 더 복잡한 조직에 적용 할 수 있습니다. 현재까지, 혈관화된 연조직의 관류 탈세포화는 설치류12, 돼지 13, 및 인간 모델(14) 뿐만 아니라 돼지 직장 복부 골격근15에서의 전층 근막 피판과 같은 단순 혈관화된 조직을 사용하여 조사되었다. 추가적으로, 복잡한 혈관화된 조직은 또한 돼지 및 인간의 귀모델(16,17) 및 인간 전면-얼굴 이식 모델(18)에서 입증된 바와 같이 관류 탈세포화되었다.
여기서, 프로토콜은 생물학적으로 유도 된 ECM 스캐 폴드를 사용하여 혈관 화 된 자유 플랩의 탈 세포 화를 설명합니다. 우리는 임상적으로 관련된 세 가지 플랩의 탈세포화를 제시합니다: 1) omentum, 2) tensor fascia lata 및 3) 방사형 팔뚝, 모두 재건 수술에서 일상적으로 사용되는 일꾼 플랩을 대표하며 조직 탈세포화의 맥락에서 동물 연구에서 이전에 조사되지 않았습니다. 이 생체 공학 플랩은 대규모 연조직 결함 복구 및 재건 분야에서 사용하기 위한 임상 응용 가능성이 있는 다재다능하고 쉽게 사용할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제안된 프로토콜은 저농도 SDS의 관류를 사용하여 다양한 돼지 유래 플랩을 탈세포화합니다. 이 절차를 통해 무세포 omentum, 텐서 근막 라타 및 방사형 팔뚝 플랩은 저농도 SDS를 선호하는 프로토콜을 사용하여 성공적으로 탈세포화될 수 있습니다. 예비 최적화 실험에 따르면 2일에서 5일 사이에 낮은 농도(0.05%)의 SDS가 조직학적 기술로 분석했을 때 망막, 텐서 근막 라타 및 방사형 팔뚝 플랩에 대한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음
Materials
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
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