이 프로토콜은 맞춤형 관류 생물 반응기에서 플랩 혈관 구조를 통해 나트륨 도데 실 설페이트 세제의 관류에 의한 혈관 화 된 돼지 플랩의 외과 적 조달 및 후속 탈세포화를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
대량의 연조직 결함은 기능적 결함을 유발하고 환자의 삶의 질에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 자가 자유 피판 이식 또는 혈관화 복합 동종 이식 (VCA)을 사용하여 외과 적 재건을 수행 할 수 있지만, 이러한 방법에는 단점도 있습니다. 기증자 부위 이환율 및 조직 가용성과 같은 문제는 자가 자유 피판 전달을 제한하는 반면, 면역억제는 VCA의 중요한 한계입니다. 탈세포화/재세포화 방법을 사용하는 재건 수술에서 조작된 조직은 가능한 해결책을 제시합니다. 탈세포화된 조직은 기본 세포외 기질(ECM) 마이크로아키텍처를 보존하면서 천연 세포 물질을 제거하는 방법을 사용하여 생성됩니다. 이어서, 이들 무세포 스캐폴드는 후속적으로 수용자-특이적 세포로 재세포화될 수 있다.
이 프로토콜은 돼지 모델에서 무세포 스캐폴드를 달성하는 데 사용되는 조달 및 탈세포화 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 관류 바이오리액터 설계 및 설정에 대한 설명도 제공한다. 플랩에는 돼지 omentum, 텐서 근막 라타 및 방사형 팔뚝이 포함됩니다. 탈세포화는 저농도 도데실 황산나트륨(SDS) 세제의 생체 외 관류에 이어 맞춤형 관류 바이오리액터에서 DNase 효소 처리 및 과초산 살균을 통해 수행됩니다.
성공적인 조직 탈세포화는 거시적으로 플랩의 흰색 불투명 외관을 특징으로 합니다. 무세포 플랩은 조직 학적 염색에 핵이없고 DNA 함량이 크게 감소함을 보여줍니다. 이 프로토콜은 보존된 ECM 및 혈관 마이크로아키텍처를 사용하여 탈세포화된 연조직 스캐폴드를 생성하는 데 효율적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 스캐폴드는 후속 재세포화 연구에 사용될 수 있으며 재건 수술에서 임상 번역의 잠재력을 가지고 있습니다.
서론
외상성 손상 및 종양 제거는 크고 복잡한 연조직 결함을 유발할 수 있습니다. 이러한 결함은 환자의 삶의 질을 손상시키고 기능 상실을 유발하며 영구적 인 장애를 초래할 수 있습니다. 자가 조직 플랩 이식과 같은 기술이 일반적으로 시행되었지만 플랩 가용성 및 기증자 부위 이환율 문제는 주요 제한 사항입니다 1,2,3. 혈관화 복합 동종 이식(VCA)은 복합 조직, 예를 들어 근육, 피부, 혈관계를 단일 단위로 수혜자에게 전달하는 유망한 대안입니다. 그러나 VCA는 약물 독성, 기회 감염 및 악성 종양 4,5,6을 유발하는 장기 면역 억제가 필요합니다.
조직 공학적 무세포 스캐폴드는 이러한 한계에 대한 잠재적인 해결책입니다7. 무세포 조직 스캐폴드는 기본 세포외 기질(ECM) 마이크로아키텍처를 보존하면서 천연 조직에서 세포 물질을 제거하는 탈세포화 방법을 사용하여 얻을 수 있....
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프로토콜
동물 피험자와 관련된 모든 절차는 대학 건강 네트워크 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았으며 대학 건강 네트워크 동물 자원 센터 프로토콜 및 절차 및 캐나다 동물 관리 지침위원회에 따라 수행됩니다. 5 마리의 요크셔 돼지 (35-50 kg, 약 12 주령)가 모든 실험에 사용되었습니다.
1. 관류 생물 반응기 제작
- 관류 바이오리액터에 사용되는 모든 성분에 대해서는 도 1 을 참조한다. 티슈 챔버를 제조하려면 실리콘 씰 라이닝이 포함된 방수 및 밀폐 뚜껑이 있는 시판되는 폴리프로필렌 스냅 잠금 용기를 사용하십시오. 컨테이너가 오토클레이브와 호환되는지 확인하십시오.
- 용기 측면을 따라 두 개의 1/4 구멍을 뚫고 L/S-16 백금 코팅 실리콘 튜브의 짧은 부분을 끼웁니다. 하나의 튜브는 유입 관류를 운반하고 다른 하나는 유출용입니다.
- 유입 튜브의 경우 조직 캐뉼러에 연결하는 데 사용할 내부 부분에 수 Luer 커넥터를 부착합니다. 3방향 스톱콕에 연결하는 데 사용할 유입 튜브의 외부 끝에 암 Luer 커넥터를 부착합니다.
- 챔버 덮개에 단일 1/4인치 구멍을 뚫고 L/S-16 백금 코팅 실리콘 튜브의 다른 짧은....
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결과
혈관화된 돼지 플랩을 탈세포화하는 이 프로토콜은 맞춤형 관류 바이오리액터에서 플랩 혈관구조를 통한 이온계 세제 SDS의 관류에 의존합니다. 탈세포화 이전에는 돼지 모델에서 3개의 혈관화된 플랩을 조달하고 주 공급 용기에 따라 캐뉼러링했습니다. 플랩은 성공적인 탈세포화를 허용하기 위해 특허, 관류 가능한 혈관구조를 유지하기 위해 조달 후 즉시 플러싱되었습니다. 밀폐 된 스냅 뚜껑 용기를 사용하여 밀폐 된 환경 내에서 플랩 관류를 허용하도록 맞춤형 생물 반응기를 설계했습니다. 바이오리액터 내의 플랩의 관류는 조직 챔버에 연결된 2개의 연동 펌프를 사용하여 단일 패스 방식으로 달성되었습니다. 관류 압력은 인라인 압력 센서로 모니터링되었습니다.
탈세포화 동안, SDS 노출 기간은 처리되는 조직의 유형에 의존하였다. 기술된 관류 탈세포화 기술을 사용하여, 오멘텀, 텐서 근막 및 방사형 팔뚝 플랩을 각각 2일, 3일 및 5일 동안 0.05% SDS로 탈세포화하였다. 탈세포화 후 성공적인 살.......
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토론
제안된 프로토콜은 저농도 SDS의 관류를 사용하여 다양한 돼지 유래 플랩을 탈세포화합니다. 이 절차를 통해 무세포 omentum, 텐서 근막 라타 및 방사형 팔뚝 플랩은 저농도 SDS를 선호하는 프로토콜을 사용하여 성공적으로 탈세포화될 수 있습니다. 예비 최적화 실험에 따르면 2일에서 5일 사이에 낮은 농도(0.05%)의 SDS가 조직학적 기술로 분석했을 때 망막, 텐서 근막 라타 및 방사형 팔뚝 플랩에 대한 세포 물질을 제거할 수 있는 것으로 확인되었습니다(보충 그림 1, 보충 그림 2, 보충 그림 3). 이 방법은 짧은 시간 내에 합리적인 비용으로 탈세포화를 달성하는 간단한 접근 방식을 제공합니다. 우리의 경험에 따르면, 돼지 플랩의 탈세포화 및 살균은 2-5일이 소요되며, 밀도가 더 높은 조직(예: 5일에 팔뚝 피부 대 2일에 omentum)에 더 긴 기간 탈세포화가 필요합니다. 또한, 이 프로토콜에 사용된 저농도의 SDS는 0.05%의 낮은 SDS 농도가 SDS의 임계 미셀 농도(약 0.2<.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 & 마이크로; m pore Acrodisk 필터 | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % 염화나트륨 용액 (일반 식염수) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L 폴리프로필렌 Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk 비흡수성 수술용 넥타이 | Covidien | LS639 | |
| 3방향 스톱콕 | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| 항생제-항진균 용액, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| 아트로핀 황산염 15 mg/30ml | 서까래 8 제품 | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor | |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA Assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | Ca 없음++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | ||
| Ismatec 펌프 Tygon 3-Stop 튜빙 | Cole-Parmer | RK-96450-40 | 내부 직경: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-채널 펌프 | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec 튜빙 카세트 | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | ||
| LB 한천 Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | 멸균 테스트 한천 플레이트 |
| 황산 마그네슘 | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse 보조 인자 |
| Masterflex L / S 16 튜빙 | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg / 10 ml | 캐나다 Inc.의 제약 파트너 | ||
| Monopolar Cautery 연필 | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N° 11 메스 블레이드 | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya 라텍스 | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| 플라스틱 바베드 커넥터 1/4"에서 1/8" 튜브용 ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| 플라스틱 바베드 튜브 90° 엘보 커넥터 | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| 플라스틱 퀵턴 튜브 플러그 | McMaster-Carr | 51525K143 | 수 Luer |
| 플라스틱 퀵 턴 튜브 소켓 | McMaster-Carr | 51525K293 | 암 Luer |
| Punch 생검 도구 | Integra Miltex | 3332 | |
| 염화칼륨 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| 포비돈-요오드, 10% | 루지에 | 833133 | |
| 혈청학적 피펫, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| 스냅 뚜껑 밀폐 용기 | SnapLock | 142-3941-4 | |
| 도데실황산나트륨 분말 | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| 수술용 금속 결찰 클립, 소형 | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy 가위, 115mm, 직선 | B. Braun | BC004R | |
| TruWave 압력 모니터링 세트 | Edwards Lifesciences | PX260 |
참고문헌
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M.
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재인쇄 및 허가
