Aquisição e Perfusão-Descelularização de Flaps Vascularizados Suínos em Biorreator de Perfusão Customizado
Summary
O protocolo descreve a captação cirúrgica e subsequente descelularização de retalhos suínos vascularizados pela perfusão de detergente dodecil sulfato de sódio através da vasculatura do retalho em um biorreator de perfusão personalizado.
Abstract
Defeitos de tecido mole de grande volume levam a déficits funcionais e podem afetar muito a qualidade de vida do paciente. Embora a reconstrução cirúrgica possa ser realizada usando transferência autóloga de retalho livre ou alotransplante composto vascularizado (VCA), tais métodos também apresentam desvantagens. Questões como morbidade no local do doador e disponibilidade tecidual limitam a transferência autóloga de retalho livre, enquanto a imunossupressão é uma limitação significativa da VCA. Tecidos modificados em cirurgia reconstrutiva utilizando métodos de descelularização/recelularização representam uma possível solução. Os tecidos descelularizados são gerados usando métodos que removem o material celular nativo, preservando a microarquitetura da matriz extracelular subjacente (ECM). Esses andaimes acelulares podem então ser subsequentemente recelularizados com células específicas do receptor.
Este protocolo detalha os métodos de aquisição e descelularização utilizados para alcançar andaimes acelulares em um modelo suíno. Além disso, também fornece uma descrição do projeto e configuração do biorreator de perfusão. Os retalhos incluem o omento suíno, o tensor da fáscia lata e o antebraço radial. A descelularização é realizada via perfusão ex vivo de detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) de baixa concentração, seguido de tratamento enzimático DNase e esterilização por ácido peracético em um biorreator de perfusão personalizado.
A descelularização tecidual bem-sucedida é caracterizada por uma aparência branco-opaca de retalhos macroscopicamente. Os retalhos acelulares mostram a ausência de núcleos na coloração histológica e uma redução significativa no conteúdo de DNA. Este protocolo pode ser usado de forma eficiente para gerar andaimes de tecidos moles descelularizados com MEC preservada e microarquitetura vascular. Tais andaimes podem ser utilizados em estudos subsequentes de recelularização e têm potencial para tradução clínica em cirurgia reconstrutiva.
Introduction
A lesão traumática e a remoção do tumor podem levar a defeitos grandes e complexos dos tecidos moles. Esses defeitos podem prejudicar a qualidade de vida do paciente, causar perda de função e resultar em incapacidade permanente. Embora técnicas como a transferência autóloga do retalho tecidual tenham sido comumente praticadas, problemas com a disponibilidade do retalho e a morbidade do local doador são as principais limitações 1,2,3. O alotransplante composto vascularizado (VCA) é uma alternativa promissora que transfere tecidos compostos, por exemplo, músculo, pele, vasculatura, como uma única unidade para os receptores. No entanto, a VCA requer imunossupressão em longo prazo, o que leva à toxicidade medicamentosa, infecções oportunistas e neoplasias malignas 4,5,6.
Os andaimes acelulares de engenharia tecidual são uma solução potencial para essas limitações7. Os andaimes de tecido acelular podem ser obtidos usando métodos de descelularização, que removem o material celular dos tecidos nativos, preservando a microarquitetura da matriz extracelular subjacente (ECM). Em contraste com o uso de materiais sintéticos na engenharia de tecidos, o uso de andaimes biologicamente derivados oferece um substrato biomimético de ECM que permite a biocompatibilidade e o potencial de tradução clínica8. Após a descelularização, a subsequente recelularização de andaimes com células específicas do receptor pode gerar tecidos funcionais, vascularizados, com pouca ou nenhuma imunogenicidade 9,10,11. Ao desenvolver um protocolo eficaz para obter tecidos acelulares usando técnicas de descelularização por perfusão, uma ampla gama de tipos de tecidos pode ser projetada. Por sua vez, a construção desta técnica permite a aplicação em tecidos mais complexos. Até o momento, a descelularização perfusional de tecidos moles vascularizados tem sido investigada utilizando tecidos vascularizados simples, como retalho fasciocutâneo de espessura total em roedores 12, suínos13 e humanos14, bem como músculo esquelético reto abdominal suíno15. Além disso, tecidos vascularizados complexos também foram descelularizados por perfusão, como demonstrado nos modelos de orelha suína e humana 16,17 e nos modelos de enxerto de face inteira humana18.
Aqui, o protocolo descreve a descelularização de retalhos livres vascularizados utilizando andaimes de MEC derivados biologicamente. Apresentamos a descelularização de três retalhos clinicamente relevantes: 1) o omento, 2) o tensor fáscia lata e 3) o antebraço radial, todos representativos de retalhos de cavalos de trabalho utilizados rotineiramente em cirurgia reconstrutiva e não foram previamente examinados em estudos com animais no contexto da descelularização tecidual. Esses retalhos de bioengenharia oferecem uma plataforma versátil e prontamente disponível que tem o potencial para aplicações clínicas para uso no campo da reparação e reconstrução de grandes defeitos de tecidos moles.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo proposto utiliza a perfusão de SDS de baixa concentração para descelularizar uma gama de retalhos derivados de suínos. Com este procedimento, o omento acelular, o tensor da fáscia lata e os retalhos radiais do antebraço podem ser descelularizados com sucesso usando um protocolo que favorece a SDS de baixa concentração. Experimentos preliminares de otimização determinaram que a SDS em baixa concentração (0,05%) entre 2 dias a 5 dias é capaz de remover material celular para o omento, tensor da fás…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum
Materials
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
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