Закупка и перфузионно-децеллюляризация васкуляризованных лоскутов свиней в индивидуальном перфузионном биореакторе
Summary
Протокол описывает хирургическую закупку и последующую децеллюляризацию васкуляризированных лоскутов свиней путем перфузии моющего средства додецилсульфата натрия через сосудистую ткань лоскута в индивидуальном перфузионном биореакторе.
Abstract
Дефекты мягких тканей большого объема приводят к функциональному дефициту и могут сильно повлиять на качество жизни пациента. Хотя хирургическая реконструкция может быть выполнена с использованием аутологичного переноса свободного лоскута или васкуляризированной композитной аллотрансплантации (VCA), такие методы также имеют недостатки. Такие проблемы, как заболеваемость донорского участка и доступность тканей, ограничивают аутологичный свободный перенос лоскута, в то время как иммуносупрессия является значительным ограничением VCA. Инженерные ткани в реконструктивной хирургии с использованием методов децеллюляризации/ рецеллюляризации представляют собой возможное решение. Децеллюляризированные ткани генерируются с использованием методов, которые удаляют нативный клеточный материал, сохраняя при этом базовую микроархитектуру внеклеточного матрикса (ECM). Эти бесклеточные каркасы затем могут быть впоследствии рецеллюляризированы с помощью клеток, специфичных для реципиента.
Этот протокол подробно описывает методы закупок и децеллюляризации, используемые для достижения бесклеточных каркасов в модели свиньи. Кроме того, он также предоставляет описание конструкции и установки перфузионного биореактора. Лоскуты включают свиной сальник, тензорную фасцию лата и радиальное предплечье. Децеллюляризация проводится с помощью перфузии ex vivo моющего средства додецилсульфата натрия (SDS) с последующей обработкой ферментами ДНКазы и стерилизацией перуксусной кислоты в индивидуальном перфузионном биореакторе.
Успешная децеллюляризация тканей характеризуется бело-непрозрачным появлением лоскутов макроскопически. Бесклеточные лоскуты показывают отсутствие ядер на гистологическом окрашивании и значительное снижение содержания ДНК. Этот протокол может быть эффективно использован для создания децеллюляризованных каркасов мягких тканей с сохраненной ECM и микроархитектурой сосудов. Такие каркасы могут быть использованы в последующих исследованиях рецеллюляризации и имеют потенциал для клинической трансляции в реконструктивной хирургии.
Introduction
Травматическое повреждение и удаление опухоли могут привести к большим и сложным дефектам мягких тканей. Эти дефекты могут ухудшить качество жизни пациента, вызвать потерю функции и привести к постоянной инвалидности. В то время как такие методы, как аутологичный перенос лоскута тканей, широко практикуются, проблемы с доступностью лоскута и заболеваемостью донорским участком являются основными ограничениями 1,2,3. Васкуляризированная композитная аллотрансплантация (VCA) является перспективной альтернативой, которая передает композитные ткани, например, мышцы, кожу, сосудистую систему, как единое целое реципиентам. Однако VCA требует длительной иммуносупрессии, что приводит к лекарственной токсичности, оппортунистическим инфекциям и злокачественным новообразованиям 4,5,6.
Тканеинженерные бесклеточные каркасы являются потенциальным решением этих ограничений7. Каркасы бесклеточной ткани могут быть получены с использованием методов децеллюляризации, которые удаляют клеточный материал из нативных тканей с сохранением лежащей в основе микроархитектуры внеклеточного матрикса (ECM). В отличие от использования синтетических материалов в тканевой инженерии, использование биологически полученных каркасов предлагает биомиметический СУБСТРАТ ECM, который обеспечивает биосовместимость и потенциал для клинической трансляции8. После децеллюляризации последующая рецеллюляризация каркасов с реципиент-специфическими клетками может затем генерировать функциональные, васкуляризированные ткани практически без иммуногенности 9,10,11. Разрабатывая эффективный протокол для получения бесклеточных тканей с использованием методов перфузионной децеллюляризации, можно спроектировать широкий спектр типов тканей. В свою очередь, построение на этой методике позволяет наносить на более сложные ткани. На сегодняшний день перфузионная децеллюляризация васкуляризированных мягких тканей была исследована с использованием простых васкуляризированных тканей, таких как фасциокожный лоскут полной толщины у грызунов12,свиней 13 и человеческих моделей14, а также скелетной мышцы грудной части животасвиней 15. Кроме того, сложные васкуляризированные ткани также были децеллюляризированы перфузией, как показано на моделях свиньих и человеческих ушей 16,17 и моделях полнолицего трансплантата человека18.
Здесь протокол описывает децеллюляризацию васкуляризированных свободных лоскутов с использованием биологически полученных каркасов ECM. Мы представляем децеллюляризацию трех клинически значимых лоскутов: 1) сальника, 2) тензорной фасции лата и 3) радиального предплечья, все из которых являются репрезентативными лоскутами рабочей лошадки, регулярно используемыми в реконструктивной хирургии и ранее не исследовались в исследованиях на животных в контексте децеллюляризации тканей. Эти биоинженерные клапаны предлагают универсальную и легкодоступную платформу, которая имеет потенциал для клинических применений для использования в области восстановления и реконструкции больших дефектов мягких тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предлагаемый протокол использует перфузию SDS низкой концентрации для децеллюляризации ряда лоскутов, полученных из свиней. С помощью этой процедуры бесклеточный сальник, тензорная фасция лата и радиальные клапаны предплечья могут быть успешно децеллюляризированы с использованием п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Никакой
Materials
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
- Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).
- Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
- Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
- Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering – Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
- Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).
- Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
- Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
- Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
- Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).
- Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
- Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).
- Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
- Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).
