Approvvigionamento e decellularizzazione degli arti posteriori di ratto utilizzando un bioreattore ex vivo basato sulla perfusione per allotrapianto composito vascolarizzato
Summary
Descriviamo la tecnica chirurgica e il processo di decellularizzazione per gli arti posteriori compositi di ratto. La decellularizzazione viene condotta utilizzando dodecilsolfato di sodio a bassa concentrazione attraverso un sistema di perfusione ex vivo .
Abstract
I pazienti con gravi lesioni traumatiche e perdita di tessuto richiedono una ricostruzione chirurgica complessa. L’allotrapianto composito vascolarizzato (VCA) è una via ricostruttiva in evoluzione per il trasferimento di più tessuti come subunità composita. Nonostante la natura promettente della VCA, i requisiti immunosoppressivi a lungo termine sono una limitazione significativa a causa dell’aumentato rischio di tumori maligni, tossicità da organi terminali e infezioni opportunistiche. L’ingegneria tissutale degli scaffold compositi acellulari è una potenziale alternativa per ridurre la necessità di immunosoppressione. Qui viene descritto l’approvvigionamento di un arto posteriore di ratto e la sua successiva decellularizzazione mediante dodecilsolfato di sodio (SDS). La strategia di approvvigionamento presentata si basa sull’arteria femorale comune. Un sistema di bioreattore basato sulla perfusione meccanica è stato costruito e utilizzato per la decellularizzazione ex vivo dell’arto posteriore. È stata eseguita con successo la decellularizzazione della perfusione, con conseguente aspetto bianco traslucido dell’arto posteriore. È stata osservata una rete vascolare intatta, perfusibile in tutto l’arto posteriore. Le analisi istologiche hanno mostrato la rimozione del contenuto nucleare e la conservazione dell’architettura tissutale in tutti i compartimenti tissutali.
Introduction
La VCA è un’opzione emergente per i pazienti che richiedono una ricostruzione chirurgica complessa. Lesioni traumatiche o resezioni tumorali provocano una perdita volumetrica di tessuto che può essere difficile da ricostruire. VCA offre il trapianto di più tessuti come pelle, ossa, muscoli, nervi e vasi come innesto composito da un donatore a un ricevente1. Nonostante la sua natura promettente, VCA è limitato a causa di regimi immunosoppressivi a lungo termine. L’uso permanente di tali farmaci comporta un aumento del rischio di infezioni opportunistiche, tumori maligni e tossicità per organi terminali 1,2,3. Per contribuire a ridurre e / o eliminare la necessità di immunosoppressione, gli scaffold di ingegneria tissutale che utilizzano approcci di decellularizzazione per VCA mostrano grandi promesse.
La decellularizzazione dei tessuti comporta il mantenimento della struttura della matrice extracellulare mentre rimuove il contenuto cellulare e nucleare. Questa impalcatura decellularizzata può essere ripopolata con cellule paziente-specifiche4. Tuttavia, preservare la rete ECM di tessuti compositi è un’ulteriore sfida. Ciò è dovuto alla presenza di più tipi di tessuto con diverse densità di tessuto, architetture e posizioni anatomiche all’interno di un’impalcatura. Il presente protocollo offre una tecnica chirurgica e un metodo di decellularizzazione per un arto posteriore di ratto. Questo è un modello proof-of-concept per l’applicazione di questa tecnica di ingegneria tissutale ai tessuti compositi. Ciò può anche richiedere sforzi successivi per rigenerare i tessuti compositi attraverso la ricellularizzazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli arti posteriori dei ratti sono utili come modelli sperimentali in VCA5. L’ingegneria tissutale degli scaffold acellulari rappresenta il primo passo per affrontare le carenze dei regimi di immunosoppressione a lungo termine associati alla VCA. L’uso di innesti compositi rappresenta un’ulteriore sfida data la presenza di più tessuti, ognuno con proprietà funzionali, immunogeniche e strutturali uniche. Il presente protocollo mostra un metodo efficace per ottenere arti posteriori compositi acell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Figura 3A è stata creata in BioRender.com.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade – #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
References
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