Freilandfähiger Candidatus liberibacter asiaticus-Nachweis mittels Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a
Summary
In dieser Arbeit wurde eine schnelle, empfindliche und tragbare Nachweismethode für Candidatus Liberibacter asiaticus entwickelt, die auf Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a basiert.
Abstract
Die Früherkennung von Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) durch Zitrusbauern erleichtert ein frühzeitiges Eingreifen und verhindert die Ausbreitung von Krankheiten. Eine einfache Methode zur schnellen und tragbaren Huanglongbing (HLB) -Diagnose wird hier vorgestellt, die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation und einen Fluoreszenzreporter kombiniert, der die Nukleaseaktivität des Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a) -Systems nutzt. Die Sensitivität dieser Technik ist viel höher als die PCR. Darüber hinaus zeigte diese Methode ähnliche Ergebnisse wie qPCR, wenn Blattproben verwendet wurden. Im Vergleich zu herkömmlichen CLas-Nachweismethoden kann das hier vorgestellte Nachweisverfahren in 90 min abgeschlossen werden und arbeitet in einem isothermen Zustand, der den Einsatz von PCR-Geräten nicht erfordert. Darüber hinaus können die Ergebnisse durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät im Feld visualisiert werden.
Introduction
Huanglongbing (HLB) ist eine der problematischsten Zitruskrankheiten weltweit1. HLB wird durch die phloemkolonisierenden und anspruchsvollen Bakterien Candidatus Liberibacter spp. verursacht, einschließlich Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus und Ca. L. americanus 2. Die häufigste HLB-assoziierte Art in China und den USA ist CLas, die durch asiatische Zitruspsylliden (Diaphorina citri) oder durch Pfropfen übertragenwird 3. Nach der Infektion mit CLas zeigen Zitrusbäume einen Wachstumsrückgang bis zum Tod2. Die häufigsten Symptome von Zitrusblättern, die mit CLas infiziert sind, sind fleckige Flecken, grüne Inseln (kleine kreisförmige dunkelgrüne Punkte), erhöhte korkige Adern auf dickeren und ledrigen Blättern und ungleichmäßige vergilbte Triebe2. Darüber hinaus erscheinen mit CLas infizierte Früchte klein und schief2.
Da keine Zitrussorte gegen HLB resistent ist und es keine therapeutische Heilung für HLB gibt, erfordert die Prävention von HLB die Quarantäne und Isolierung von CLas-positiven Zitrusbäumen 2,3. Daher ist die Früherkennung entscheidend für die Überwachung und Quarantäne, um die Ausbreitung von CLas zu verhindern und wirtschaftliche Verluste zu minimieren3. Darüber hinaus ist ein empfindlicher CLas-Nachweis aufgrund des niedrigen Titers von CLas in Pflanzen im frühen Stadium der Infektion erforderlich3. In China wird die CLas-Erkennung in der Regel von bestimmten zertifizierten Testzentren durchgeführt. Der Erkennungsprozess dauert jedoch in der Regel mindestens 1 Woche und die Erkennungsgebühr ist teuer. Um die HLB-Inzidenz zu überwachen,
Verschiedene Technologien wurden angewendet, um HLB 4,5,6,7,8,9 zu diagnostizieren. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und quantitative PCR (qPCR) sind aufgrund ihrer hohen Sensitivität und Spezifität die am häufigsten verwendeten Werkzeuge für den CLas-Nachweis 4,5. Diese Technologien hängen jedoch stark von teuren Instrumenten und hochqualifiziertem Personal ab. Darüber hinaus wurden mehrere isotherme Amplifikationsmethoden, wie die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP), aufgrund ihrer Einfachheit, Schnelligkeit und niedrigen Kosten als attraktive Alternativen zu herkömmlichen PCR-Methoden entwickelt 8,9,10. Es ist jedoch schwierig, sie anzuwenden, um CLas aufgrund der unspezifischen Verstärkungssignale genau zu erkennen, was zu falsch-positiven Ergebnissen führen kann.
RNA-gesteuerter CRISPR/Cas (Clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-assoziierter) Endonuklease-basierter Nukleinsäurenachweis wurde aufgrund seiner hohen Sensitivität, Spezifität und Zuverlässigkeit als molekulardiagnostische Technologie der nächsten Generation entwickelt11,12,13,14. Diese CRISPR/Cas-Diagnostiktechnologien beruhen auf der kollateralen Nukleaseaktivität von Cas-Proteinen, um einzelsträngige DNA (ssDNA) zu spalten, die mit einem fluoreszierenden Reporter und einem Fluoreszenzlöscher an jedem Ende der Oligonukleotide modifiziert wurde, sowie einer Fluoreszenzdetektionsvorrichtung zur Erfassung des freigesetzten Fluoreszenzreporters11,12 . Die Nukleaseaktivität mehrerer Cas-Effektoren, die durch den CRISPR-RNA (crRNA)-Zielduplex aktiviert werden, kann die umgebende Nicht-Ziel-ssDNA11 wahllos spalten. CRISPR-Cas12a (auch Cpf 1 genannt), ein CRISPR/Cas-System der Klasse 2 Typ V-A, weist im Vergleich zu Cas9 mehrere Vorteile auf, wie z. B. eine geringere Fehlanpassungstoleranz und eine größere Spezifität13. Das Cas12a/crRNA-System wurde für den sensitiven und spezifischen Nachweis der Nukleinsäuren humanpathogener und phytopathogener 14,15,16,17,18 eingesetzt. Daher sollte die Verwendung des Cas12a/crRNA-Systems den genauen und empfindlichen Nachweis der Nukleinsäure von CLas ermöglichen.
Cas12a allein ist theoretisch nicht empfindlich genug, um niedrige Konzentrationen von Nukleinsäuren nachzuweisen. Um seine Detektionsempfindlichkeit zu verbessern, wird der CRISPR-Cas12a-Nachweis daher typischerweise mit einem isothermen Amplifikationsschritt14,15 kombiniert. Die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) ermöglicht eine empfindliche und schnelle isotherme DNA-Amplifikation in einem Temperaturbereich von 37 °C bis 42 °C19.
Eine Detektionsplattform namens DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), die die DNase-Aktivität von Cas12a mit RPA und einer Fluoreszenzanzeige kombiniert, wurde kürzlich entwickelt12 und es wurde gezeigt, dass sie Nukleinsäure mit höherer Empfindlichkeit detektiert20. Darüber hinaus kann das von den positiven Proben emittierte Fluoreszenzsignal durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät im Feld beobachtet werden.
Da wir DNA mit RPA amplifizierten, crRNA entwickelten, die auf das CLas-21-spezifische Gen nrdB (Ribonukleotidreduktase β-Untereinheit) abzielt, und die DNase-Aktivität des Cas12a-Proteins verwendeten, nannten wir diese CLas-Nachweismethode CLas-DETECTR. Im Vergleich zu bestehenden CLas-Erkennungsmethoden ist CLas-DETECTR schnell, genau, empfindlich und einsetzbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie stellt eine schnelle und tragbare Methode zum Nachweis von CLas namens CLas-DETECTR vor, die die Systeme RPA und CRISPR-Cas12a kombiniert. Der Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. CLas-DETECTR erkennt CLas mit Spezifität und Sensitivität (Abbildung 2 und Abbildung 3). Darüber hinaus detektiert CLas-DETECTR mithilfe von Newhall-Blattproben CLas mit der gleichen Empfindlichkeit wie qPCR (<strong cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch das National Key R & D Program of China (2021YFD1400805), das Major Science and Technology R & D Program der Provinz Jiangxi (20194ABC28007), Projects of Jiangxi Education Department (GJJ201449) und die Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research in Jiangxi Province (JXXTCX2015002(3+2)-003).
Materials
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
| Hole puncher | Deli | 114 | China | |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
| NaOH | SCR | 10019718 | China | |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
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