Полевое развертывание Candidatus Liberibacter asiaticus Detection с использованием амплификации полимеразы рекомбиназы в сочетании с CRISPR-Cas12a
Summary
В этой работе был разработан быстрый, чувствительный и портативный метод обнаружения Candidatus Liberibacter asiaticus на основе амплификации полимеразы рекомбиназы в сочетании с CRISPR-Cas12a.
Abstract
Раннее выявление Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) производителями цитрусовых облегчает раннее вмешательство и предотвращает распространение заболевания. Здесь представлен простой метод быстрой и портативной диагностики Huanglongbing (HLB), который сочетает в себе амплификацию полимеразы рекомбиназы и флуоресцентный репортер, использующий нуклеазную активность кластеризованной регулярно интерраспространенной короткой палиндромной системы / CRISPR-ассоциированных 12a (CRISPR-Cas12a). Чувствительность этой методики намного выше, чем ПЦР. Кроме того, этот метод показал результаты, аналогичные qPCR, когда использовались образцы листьев. По сравнению с обычными методами обнаружения CLas, метод обнаружения, представленный здесь, может быть завершен за 90 мин и работает в изотермическом состоянии, не требующем использования аппаратов ПЦР. Кроме того, результаты могут быть визуализированы с помощью портативного флуоресцентного устройства обнаружения в полевых условиях.
Introduction
Хуанлунбин (HLB) является одним из самых проблемных цитрусовых заболеваний во всем мире1. HLB вызывается флоэмно-колонизирующими и привередливыми бактериями Candidatus Liberibacter spp., включая Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus и Ca. L. americanus2. Наиболее распространенным HLB-ассоциированным видом в Китае и США является CLas, который передается азиатскими цитрусовыми псиллидами (Diaphorina citri) или через прививку3. После заражения CLas цитрусовые деревья демонстрируют снижение роста до смерти2. Общими симптомами листьев цитрусовых, инфицированных CLas, являются пятнистая пятнистость, зеленые островки (маленькие круглые темно-зеленые точки), приподнятые пробковые прожилки на более толстых и кожистых листьях и неоднородные желтеющие побеги2. Кроме того, плоды, зараженные КЛА, кажутся мелкими и однобокими2.
Поскольку ни один сорт цитрусовых не устойчив к HLB и нет терапевтического лечения HLB, профилактика HLB требует карантина и изоляции CLas-положительных цитрусовых деревьев 2,3. Поэтому раннее выявление имеет решающее значение для мониторинга и карантина, чтобы предотвратить распространение CLas и минимизировать экономические потери3. Кроме того, необходимо обнаружение чувствительных CLas из-за низкого титра CLas у растений на ранней стадии инфекции3. В Китае обнаружение CLas обычно проводится определенными сертифицированными испытательными центрами. Тем не менее, процесс обнаружения обычно занимает не менее 1 недели, а плата за обнаружение стоит дорого. Таким образом, чтобы помочь контролировать заболеваемость HLB
Для диагностики HLB 4,5,6,7,8,9 были применены различные технологии. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и количественная ПЦР (qPCR) являются наиболее используемыми инструментами для обнаружения CLas из-за их высокой чувствительности и специфичности 4,5. Однако эти технологии в значительной степени зависят от дорогостоящих инструментов и высококвалифицированного персонала. Кроме того, несколько методов изотермической амплификации, таких как петлевая изотермическая амплификация (LAMP), были разработаны в качестве привлекательных альтернатив традиционным методам ПЦР из-за их простоты, быстроты и низкой стоимости 8,9,10. Тем не менее, трудно применить их для точного обнаружения CA из-за неспецифических сигналов усиления, которые могут привести к ложноположительным результатам.
РНК-управляемый CRISPR/Cas (кластеризованный регулярно чередующийся короткие палиндромные повторы/CRISPR-ассоциированный) обнаружение нуклеиновых кислот на основе эндонуклеазы было разработано как технология молекулярной диагностики следующего поколения благодаря своей высокой чувствительности, специфичности и надежности 11,12,13,14. Эти технологии диагностики CRISPR/Cas основаны на коллатеральной нуклеазной активности белков Cas для расщепления одноцепочечной ДНК (ssDNA), модифицированной флуоресцентным репортером и флуоресцентным гасителем на каждом конце олигонуклеотидов, а также на устройстве обнаружения флуоресценции для захвата выпущенного флуоресцентного репортера11,12 . Нуклеазная активность нескольких эффекторов Cas, активированных дуплексом-мишенью CRISPR РНК (crRNA), может без разбора расщеплять окружающую нецелевую ssDNA11. CRISPR-Cas12a (также называемая Cpf 1), система V-A CRISPR/Cas типа класса 2, демонстрирует несколько преимуществ по сравнению с Cas9, таких как более низкий допуск на несоответствие и большая специфичность13. Система Cas12a/crRNA была применена для чувствительного и специфического обнаружения нуклеиновых кислот патогенов человека и фитопатогенов 14,15,16,17,18. Поэтому использование системы Cas12a/crRNA должно обеспечить точное и чувствительное обнаружение нуклеиновой кислоты CLas.
Cas12a сам по себе недостаточно теоретически чувствителен для обнаружения низких уровней нуклеиновых кислот. Поэтому, чтобы улучшить чувствительность обнаружения, обнаружение CRISPR-Cas12a обычно сочетается с изотермической стадией усиления14,15. Амплификация рекомбиназы полимеразы (RPA) обеспечивает чувствительную и быструю изотермическую амплификацию ДНК в диапазоне температур от 37 °C до 42 °C19.
Недавно была разработана платформа обнаружения под названием DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), которая сочетает в себе активность ДНКазы Cas12a с RPA и флуоресцентным считыванием12 и, как было показано, обнаруживает нуклеиновые кислоты с более высокой чувствительностью20. Кроме того, флуоресцентный сигнал, излучаемый положительными образцами, можно наблюдать через портативное устройство обнаружения флуоресценции в полевых условиях.
Поскольку мы амплировали ДНК с помощью RPA, разработали crRNA, нацеленную на пятикопийный ген nrdB (рибонуклеотидредуктаза β-субъединица), специфичный для CLas21, и использовали активность ДНКазы белка Cas12a, мы назвали этот метод обнаружения CLas CLas-DETECTR. По сравнению с существующими методами обнаружения CA, CLas-DETECTR является быстрым, точным, чувствительным и развертываемым.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование представляет собой быстрый и портативный метод обнаружения CA под названием CLas-DETECTR, который сочетает в себе системы RPA и CRISPR-Cas12a. Рабочий процесс показан на рисунке 1. CLas-DETECTR обнаруживает CA со специфичностью и чувствительностью (рисунок 2 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была финансово поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2021YFD1400805), Программой исследований и разработок в области науки и техники провинции Цзянси (20194ABC28007), проектами Департамента образования Цзянси (GJJ201449) и Совместными инновациями современных сельскохозяйственных научных исследований в провинции Цзянси (JXXTCX2015002(3 +2)-003).
Materials
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
| Hole puncher | Deli | 114 | China | |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
| NaOH | SCR | 10019718 | China | |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O’Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen (‘Candidatus Liberibacter asiaticus’) using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
