Bu çalışmada, Candidatus Liberibacter asiaticus için CRISPR-Cas12a ile kombine rekombinaz polimeraz amplifikasyonuna dayanan hızlı, hassas ve taşınabilir bir tespit yöntemi geliştirilmiştir.
Candidatus Liberibacter asiaticus’un (CLas) narenciye yetiştiricileri tarafından erken tespiti, erken müdahaleyi kolaylaştırır ve hastalığın yayılmasını önler. Hızlı ve taşınabilir Huanglongbing (HLB) tanısı için rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu ve kümelenmiş düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili 12a (CRISPR-Cas12a) sisteminin nükleaz aktivitesini kullanan bir floresan muhabiri birleştiren basit bir yöntem sunulmaktadır. Bu tekniğin duyarlılığı PCR’den çok daha yüksektir. Ayrıca, bu yöntem yaprak örnekleri kullanıldığında qPCR’ye benzer sonuçlar göstermiştir. Geleneksel CLas algılama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, burada sunulan algılama yöntemi 90 dakikada tamamlanabilir ve PCR makinelerinin kullanılmasını gerektirmeyen izotermal bir durumda çalışır. Ek olarak, sonuçlar sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla görselleştirilebilir.
Huanglongbing (HLB), dünya çapında en sorunlu narenciye hastalıklarından biridir1. HLB, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus ve Ca. L. americanus2 dahil olmak üzere floem kolonize edici ve titiz bakteriler Candidatus Liberibacter spp.‘den kaynaklanır. Çin ve ABD’de HLB ile ilişkili en yaygın tür, Asya narenciye psyllidleri (Diaphorina citri) veya aşılama yoluyla bulaşan CLas’tır3. CLas tarafından enfekte edildikten sonra, narenciye ağaçları ölüm2’ye kadar büyüme düşüşü gösterir. CLas ile enfekte olmuş narenciye yapraklarının yaygın semptomları lekeli benek, yeşil adalar (küçük dairesel koyu yeşil noktalar), daha kalın ve kösele yapraklar üzerinde yükseltilmiş mantarlı damarlar ve düzgün olmayan sararma sürgünleridir2. Ek olarak, CLas ile enfekte olmuş meyveler küçük ve orantısız görünür2.
Hiçbir narenciye çeşidi HLB’ye dirençli olmadığından ve HLB için terapötik bir tedavi olmadığından, HLB’nin önlenmesi CLas pozitif narenciye ağaçlarının karantinaya alınmasını ve izolasyonunu gerektirir 2,3. Bu nedenle, CLas’ın yayılmasını önlemek ve ekonomik kayıpları en aza indirmek için erken teşhis izleme ve karantinaya almak için kritiköneme sahiptir 3. Ek olarak, enfeksiyonun erken evresinde bitkilerde CLas’ın düşük titresi nedeniyle hassas CLas tespiti gereklidir3. Çin’de, CLas tespiti genellikle belirli sertifikalı test merkezleri tarafından gerçekleştirilir. Bununla birlikte, algılama işlemi genellikle en az 1 hafta sürer ve tespit ücreti pahalıdır. Bu nedenle, HLB insidansını izlemeye yardımcı olmak için
HLB 4,5,6,7,8,9 tanısında çeşitli teknolojiler uygulanmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kantitatif PCR (qPCR), yüksek duyarlılıkları ve özgüllükleri nedeniyle CLas tespiti için en çok kullanılan araçlardır 4,5. Bununla birlikte, bu teknolojiler büyük ölçüde pahalı araçlara ve yüksek vasıflı personele dayanmaktadır. Ek olarak, döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) gibi çeşitli izotermal amplifikasyon yöntemleri, basitlikleri, hızları ve düşük maliyetleri nedeniyle geleneksel PCR yöntemlerine cazip alternatifler olarak geliştirilmiştir 8,9,10. Bununla birlikte, yanlış pozitif sonuçlara neden olabilecek spesifik olmayan amplifikasyon sinyalleri nedeniyle CLas’ı doğru bir şekilde tespit etmek için bunları uygulamak zordur.
RNA rehberliğinde CRISPR / Cas (düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili kümelenmiş) endonükleaz bazlı nükleik asit tespiti, yüksek hassasiyeti, özgüllüğü ve güvenilirliği nedeniyle yeni nesil bir moleküler tanı teknolojisi olarak geliştirilmiştir11,12,13,14. Bu CRISPR / Cas teşhis teknolojileri, oligonükleotidlerin her iki ucunda bir floresan muhabir ve bir floresan söndürücü ile modifiye edilmiş tek sarmallı DNA’yı (ssDNA) parçalamak için Cas proteinlerinin kollateral nükleaz aktivitesine ve ayrıca serbest bırakılan floresan muhabirini yakalamak için bir floresan tespit cihazına dayanır11,12 . CRISPR RNA (crRNA) hedef dubleks tarafından aktive edilen birkaç Cas efektörünün nükleaz aktivitesi, çevredeki hedef olmayan ssDNA11’i ayrım gözetmeksizin parçalayabilir. Sınıf 2 tip V-A CRISPR/Cas sistemi olan CRISPR-Cas12a (Cpf 1 olarak da adlandırılır), Cas9 ile karşılaştırıldığında, daha düşük uyumsuzluk toleransı ve daha fazla özgüllük13 gibi çeşitli avantajlar gösterir. Cas12a/crRNA sistemi, insan patojenlerinin ve fitopatojenlerin nükleik asitlerinin hassas ve spesifik tespiti için uygulanmıştır 14,15,16,17,18. Bu nedenle, Cas12a / crRNA sisteminin kullanılması, CLas’ın nükleik asidinin doğru ve hassas bir şekilde algılanmasını sağlamalıdır.
Cas12a tek başına teorik olarak düşük nükleik asit seviyelerini tespit edecek kadar hassas değildir. Bu nedenle, algılama hassasiyetini artırmak için, CRISPR-Cas12a algılama tipik olarak bir izotermal amplifikasyon adımı14,15 ile birleştirilir. Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA), 37 °C ila 42 °C19 sıcaklık aralığında hassas ve hızlı izotermal DNA amplifikasyonu sağlar.
Cas12a’nın DNaz aktivitesini RPA ve floresan okuması ile birleştiren DETECTR (DNA Endonükleaz Hedefli CRISPR Trans Reporter) adlı bir tespit platformu yakın zamanda12 geliştirilmiştir ve nükleik asidi daha yüksek hassasiyetle tespit ettiği gösterilmiştir20. Ayrıca, pozitif numunelerden yayılan floresan sinyali, sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla gözlemlenebilir.
DNA’yı RPA ile güçlendirdiğimizden, CLas 21’e özgü beş kopyalı nrdB (ribonükleotid redüktaz β– alt birim) genini hedefleyen crRNA’yı tasarladığımızdan veCas12a proteininin DNaz aktivitesini kullandığımızdan, buna CLas tespit yöntemini CLas-DETECTR adını verdik. Mevcut CLas algılama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, CLas-DETECTR hızlı, doğru, hassas ve konuşlandırılabilir.
Bu çalışma, RPA ve CRISPR-Cas12a sistemlerini birleştiren CLas-DETECTR adlı CLas’ı tespit etmek için hızlı ve taşınabilir bir yöntem sunmaktadır. İş akışı Şekil 1’de gösterilmiştir. CLas-DETECTR, CLas’ı özgüllük ve hassasiyetle algılar (Şekil 2 ve Şekil 3). Ayrıca, Newhall yaprak örneklerini kullanan CLas-DETECTR, CLas’ı qPCR ile aynı hassasiyetle algılar (Şekil…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2021YFD1400805), Jiangxi Eyaleti Büyük Bilim ve Teknoloji Ar-Ge Programı (20194ABC28007), Jiangxi Eğitim Departmanı Projeleri (GJJ201449) ve Jiangxi Eyaletindeki Modern Tarımsal Bilimsel Araştırmaların İşbirlikçi İnovasyonu (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
Hole puncher | Deli | 114 | China | |
Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
NaOH | SCR | 10019718 | China | |
NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |