Embryo Rescue Protocol til interspecifik hybridisering i squash
Summary
Artiklen beskriver en embryo redningsprotokol til regenerering af umodne embryoner afledt af den interspecifikke hybridisering af Cucurbita pepo og Cucurbita moschata. Protokollen kan let replikeres og vil være en vigtig ressource for squashavlsprogrammer.
Abstract
Interspecifik hybridisering i Cucurbita-afgrøder (squash) er ønskelig for at udvide genetisk variation og for introduktion af nyttige alleler. Umodne embryoner, der genereres fra disse brede kryds, skal regenereres ved hjælp af passende embryoredningsteknikker. Selvom denne teknik er veletableret for mange afgrøder, mangler der en detaljeret beskrivelse af den passende metode til squash, der ville tillade rutinemæssig anvendelse. Her beskriver vi en embryo redningsprotokol, der er nyttig til interspecifik hybridisering af C. pepo og C . moschata. For at identificere levedygtige kombinationer til embryoredning blev der udført 24 interspecifikke kryds. Frugtsæt blev opnået fra toogtyve kryds, hvilket indikerer en succesrate på 92%. Imidlertid var de fleste af de opnåede frugter parthenocarpic, med frø uden embryoner (tomme frø). Kun en krydskombination indeholdt umodne embryoner, der kunne regenereres ved hjælp af basale plantevækstmedier. I alt 10 embryoner blev reddet fra den interspecifikke F1 frugt, og succesraten for embryo redning var 80%. Embryo redningsprotokollen udviklet her vil være nyttig til interspecifik hybridisering i squashavlsprogrammer.
Introduction
Cucurbita (2n = 40) er en meget forskelligartet slægt i Cucurbitaceae-familien, der indeholder 27 forskellige arter, hvoraf fem er tæmmet1. Blandt disse er Cucurbita moschata, C. pepo og C. maxima de økonomisk vigtigste på verdensplan. I USA er C. moschata og C. pepo de to vigtigste arter i landbrugsproduktionen. C. pepo består af fire underarter (ovifera, pepo, broderlig og gumala), der indeholder både sommer og vinter squash kultivar grupper af crookneck, straightneck, agern, kammusling, cocozelle, vegetabilsk marv, courgette og græskar 2,3,4,5. C. moschata består primært af vinter squash markedstyper, herunder butternut, Dickinson og ost gruppe1. De to arter er morfologisk og fænotypisk forskellige, med C. pepo betragtet for sit udbytte, earliness, bush vækst vane og forskellige frugtegenskaber, herunder frugtform, frugtstørrelse, kødfarve og skorpe mønster. På den anden side er C. moschata værdsat for sin tilpasning til varme og fugtighed samt sygdoms- og skadedyrsresistens 6,7. Interspecifik hybridisering mellem C. moschata og C. pepo er ikke kun en vigtig strategi for introgression af ønskelige egenskaber mellem de to arter, men giver også mulighed for udvidelse af den genetiske base i avlsprogrammer 7,8.
Tidlige krydsninger mellem C. moschata og C. pepo blev foretaget for at bestemme deres kompatibilitet og / eller taksonomiske barrierer 9,10,11, mens senere undersøgelser hovedsagelig fokuserede på at overføre ønskelige træk12,13,14. Interspecifik hybridisering mellem de to arter har målrettet overførslen af nye træk såsom en busk- eller halvbuskvækstvane og forbedret udbytte fra C. pepo sammen med sygdomsresistens, tilpasningsevne til abiotisk stress og øget kraft fra C. moschata14,15,16. For eksempel har specifikke krydsninger mellem C. pepo (P5) og C. moschata (MO3) resulteret i højere frugtudbytte 13, mens C. moschata-tiltrædelser (nigeriansk lokal og Menina) er blevet anvendt i vid udstrækning som den primære kilde til resistens over for potyvirus i dyrkede C. pepo-sorter 17,18.
Tidligere undersøgelser viste, at hybridisering mellem C. moschata og C. pepo er mulig, men vanskelig 8,15. De interspecifikke krydsninger kan resultere i intet frugtsæt (abort), parthenocarpic frugter uden levedygtige frø (tomme frø), frøfrie frugter, hvor de umodne embryoner ikke udvikler sig (stenospermocarpy) eller frugter med få umodne embryoner, der kan reddes til modne planter gennem embryoredning15,16. For eksempel blev der ikke opnået levedygtige frø ved at krydse C. pepo (borddronning, moder) med C. moschata (stor ost, faderlig), men det gensidige kryds gav 57 levedygtige frø fra 134 bestøvninger9. Hayase fik kun levedygtige frø fra C. moschata og C. pepo krydser, når krydsninger blev foretaget kl. 04:00 ved hjælp af pollen opbevaret ved 10 ° C natten over19. Baggett krydsede otte forskellige C. moschata sorter med C. pepo (delicata) og rapporterede, at ud af 103 samlede bestøvninger blev der opnået 83 frugter, der syntes normale, men ingen af dem indeholdt levedygtige frø8. I en krydsning mellem C. pepo (S179) og C. moschata (NK) opnåede Zhang et al. 15 frugter med 2.994 frø, men kun 12 af disse frø var levedygtige, mens de resterende kun viste rudimentær udvikling. Disse undersøgelser tyder på, at selvom interspecifik krydsning mellem C. moschata og C. pepo er yderst gavnlig, er det krævende at opnå frugter med levedygtige frø fra krydsene16.
Embryoredning er blevet foreslået som en passende metode til at overvinde problemer som følge af tidlig abort eller dårligt udviklede embryoner og er en af de tidligste og mest succesrige in vitro-kulturteknikker til regenerering af umodne embryoner16,20. Embryoredning indebærer in vitro-kultur af underudviklede/umodne embryoner efterfulgt af overførsel til et sterilt næringsmedium for at lette genopretningen af kimplanter og i sidste ende modne planter21. Selvom embryoredning er almindeligt anvendt i squashavl, mangler der en detaljeret beskrivelse af den passende metode, der gør det muligt at anvende den rutinemæssigt. Brug af embryo redningsteknik til at overvinde interspecifikke hybridiseringsbarrierer i Cucurbita arter blev rapporteret allerede i 195422. Imidlertid var succesen med embryoredning i de tidlige undersøgelser enten urapporteret eller meget lav. Metwally et al. rapporterede en succesrate på 10% (regenerering til modne planter) blandt 100 interspecifikke hybridembryoner reddet fra en krydsning mellem C. pepo og C. martinezii23. Sisko et al. rapporterede en variabel succesrate for embryoregenerering blandt embryoner opnået fra forskellige krydskombinationer: regenereringshastigheden for hybrider opnået ved krydsning af C. maxima (Bos. Max) og C. pepo (Gold Rush) var 15,5%, for C. pepo (Zucchini) og C. moschata (Hokaido) var 20%, mens det for C. pepo (Gold Rush) og C. moschata (Dolga) var 37,5%24. Ud over genotype er medier og in vitro-kulturforhold vigtige faktorer for teknikkens succes25,26. I den nuværende undersøgelse blev forskellige krydskombinationer mellem C. moschata og C. pepo testet, og en simpel metode til udnyttelse af embryoredningsteknikken i squash blev udviklet. Udviklingen af en enkel og let reproducerbar embryo redningsteknik vil lette interspecifik hybridisering og germplasmforbedring i squashavlsprogrammer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er to hovedflaskehalse for vellykket interspecifik hybridisering mellem C. moschata og C. pepo: krydskompatibilitetsbarriere, som bestemmes af genotyperespons til at producere hybridembryoner og postbefrugtningsbarrierer, som hindrer udviklingen af hybridembryoner til normale frø. Som tidligere rapporteret for squash afslørede krydskompatibilitetstesten i den nuværende undersøgelse, at det meste af frugten udviklede sig parthenokarpisk, med de fleste frø uigennemtrængelige16<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af USDA National Institute of Food and Agriculture, NRS Project No. FLA-TRC-006176 og University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences.
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
- Paris, H. S., Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. 20, (2016).
- Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).
- Paris, H. S., et al. Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers. Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).
- Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. . Cucurbits. , (1997).
- Teppner, H. Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics. Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).
- Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters. International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).
- Paris, H. S. History of the cultivar-groups of Cucurbita pepo. Horticultural Reviews-Westport Then New York. 25, 71 (2001).
- Baggett, J. R. Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. ‘Butternut and C. pepo L. ‘Delicata’. The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).
- Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).
- Whitaker, T. W., Bohn, G. W. The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita. Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).
- Bemis, W. P., Nelson, J. M. Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development. Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).
- Washek, R. L., Munger, H. M. Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species. The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).
- Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids. International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).
- De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross. Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).
- Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique. World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).
- Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata. HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).
- Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata. Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).
- Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo). Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).
- Hayase, H. Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids. Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).
- Reed, S. Embryo rescue. Plant development and biotechnology. , 235-239 (2004).
- Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K. Embryo rescue in plants-a review. Euphytica. 89 (3), 325-337 (1996).
- Wall, J. R. Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture. Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).
- Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture. Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).
- Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique. Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).
- Giancaspro, A., et al. Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy. Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).
- Warchol, M., et al. The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses. Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).
- Nepi, M., Pacini, E. Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo. Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).
- Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).
- Moon, P., Meru, G. Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium. Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).
- Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. Plant Embryo Culture. , 107-115 (2011).
- Vining, K. J., Loy, J. B., McCreight, J. M. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. , 64-69 (1998).
- Vining, K. J. . Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , (1999).
