Expression de transgènes viraux dans les cœurs de rongeurs et évaluation du risque d’arythmie cardiaque
Summary
Le présent protocole décrit des méthodes d’expression transgénique dans le cœur de rats et de souris par injection intramyocardique directe du virus sous guidage échocardiographique. Les méthodes d’évaluation de la susceptibilité des cœurs aux arythmies ventriculaires par la stimulation électrique programmée de cœurs isolés perfusés par Langendorff sont également expliquées ici.
Abstract
Les maladies cardiaques sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde. En raison de la facilité de manipulation et de l’abondance des souches transgéniques, les rongeurs sont devenus des modèles essentiels pour la recherche cardiovasculaire. Cependant, les arythmies cardiaques létales spontanées qui causent souvent la mortalité chez les patients atteints de maladies cardiaques sont rares chez les modèles de maladies cardiaques chez les rongeurs. Cela est principalement dû aux différences entre les espèces dans les propriétés électriques cardiaques entre les humains et les rongeurs et pose un défi à l’étude des arythmies cardiaques chez les rongeurs. Ce protocole décrit une approche permettant une expression transgénique efficace dans le myocarde ventriculaire de souris et de rat en utilisant des injections intramusculaires guidées par échocardiographie de virus recombinant (adénovirus et virus adéno-associé). Ce travail décrit également une méthode permettant une évaluation fiable de la susceptibilité cardiaque aux arythmies à l’aide de cœurs de souris et de rats isolés, perfusés par Langendorff, avec des stimulations électriques adrénergiques et programmées. Ces techniques sont essentielles pour étudier les troubles du rythme cardiaque associés à un remodelage cardiaque indésirable après des blessures, telles que l’infarctus du myocarde.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde, coûtant la vie à 18 millions de personnes rien qu’en 20171. Les rongeurs, en particulier les souris et les rats, sont devenus le modèle le plus couramment utilisé dans la recherche cardiovasculaire en raison de la facilité de manipulation et de la disponibilité de diverses surexpressions transgéniques ou de lignes knockout. Les modèles de rongeurs ont été fondamentaux pour comprendre les mécanismes de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans l’infarctus du myocarde2, l’hypertension3, l’insuffisance cardiaque4 et l’athérosclérose5. Cependant, l’utilisation de rongeurs dans les études sur les arythmies cardiaques est limitée par leur petite taille cardiaque et leur fréquence cardiaque plus rapide par rapport aux modèles humains ou aux grands animaux. Par conséquent, les arythmies létales spontanées chez la souris ou le rat après un infarctus du myocarde sont rares2. Les chercheurs sont obligés de se concentrer sur les changements secondaires indirects qui pourraient refléter un substrat pro-arythmique, tels que la fibrose ou l’expression génique, sans montrer de changements significatifs dans la charge de l’arythmie ou les tendances pro-arythmiques. Pour surmonter cette limitation, une méthode permettant une évaluation fiable de la susceptibilité des cœurs de souris et de rats aux tachyarythmies ventriculaires après modification génétique 6,7 ou infarctus du myocarde2 est décrite dans le présent protocole. Cette méthode combine la stimulation des récepteurs adrénergiques avec la stimulation électrique programmée pour induire des tachyarythmies ventriculaires dans des cœurs isolés de souris et de rats perfuséspar Langendorff.
Les approches standard pour le transfert de gènes viraux dans le tissu myocardique des rongeurs impliquent souvent l’exposition du cœur par thoracotomie 9,10,11, qui est une procédure invasive et est associée à une récupération retardée des animaux après la procédure. Cet article décrit une méthode d’injection intramyocardique directe de virus sous guidage d’imagerie par ultrasons pour la surexpression de transgènes. Cette procédure moins invasive permet une récupération plus rapide de l’animal après une injection virale et moins de lésions tissulaires, par rapport à la thoracotomie, réduit la douleur postopératoire et l’inflammation chez l’animal et, ainsi, permet une meilleure évaluation des effets des gènes transgéniques sur la fonction cardiaque.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs étapes sont essentielles au succès de la préparation cardiaque isolée perfusée par Langendorff. Tout d’abord, il est important d’éviter tout dommage au cœur pendant la collecte du cœur (par exemple, en raison d’une compression accidentelle ou d’une coupure avec les ciseaux). Deuxièmement, il est essentiel de mettre le cœur recueilli dans une solution froide de Tyrode dès que possible, car cela arrêtera le rythme cardiaque et réduira la consommation d’oxygène du cœur. Troisièmement, l?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par les subventions Projet des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (PJT-148918 et PJT-180533, à WL), la Bourse de chercheur en début de carrière des IRSC (AR8-162705, à WL), la Bourse McDonald et la Bourse de nouveau chercheur de la Fondation des maladies du cœur du Canada (FMCC) (S-17-LI-0866, à WL), des bourses d’études (à JW et YX) et une bourse postdoctorale (à AL) du Fonds de dotation en cardiologie de l’Université d’Ottawa à l’Institut de cardiologie. Les auteurs remercient M. Richard Seymour pour son soutien technique. La figure 2 a été créée avec Biorender.com avec des licences approuvées.
Materials
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
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