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생화학

कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी द्वारा इन विट्रो में एक्टिन और सूक्ष्मनलिका युग्मन गतिशीलता की कल्पना करना

Published: July 20, 2022
doi:
10.3791/64074
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, and Department of Neuroscience & Physiology,State University of New York (SUNY) Upstate Medical University

Summary

यह प्रोटोकॉल इन विट्रो कुल आंतरिक प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी परख का उपयोग करके गतिशील एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं की कल्पना करने के लिए एक गाइड है।

Abstract

परंपरागत रूप से, एक्टिन और सूक्ष्मनलिका साइटोस्केलेटन का अध्ययन अलग-अलग संस्थाओं के रूप में किया गया है, जो विशिष्ट सेलुलर क्षेत्रों या प्रक्रियाओं तक सीमित है, और प्रत्येक बहुलक के लिए अद्वितीय बाध्यकारी प्रोटीन के विभिन्न सूट द्वारा विनियमित किया गया है। कई अध्ययनों से अब पता चलता है कि दोनों साइटोस्केलेटल पॉलिमर की गतिशीलता आपस में जुड़ी हुई है और अधिकांश सेलुलर व्यवहारों के लिए इस क्रॉसस्टॉक की आवश्यकता होती है। एक्टिन-सूक्ष्मनलिकाएं इंटरैक्शन में शामिल कई प्रोटीन पहले से ही पहचाने जा चुके हैं (यानी, ताऊ, एमएसीएफ, जीएएस, फॉर्मिन, और अधिक) और अकेले एक्टिन या सूक्ष्मनलिकाएं के संबंध में अच्छी तरह से विशेषता है। हालांकि, अपेक्षाकृत कम अध्ययनों ने दोनों पॉलिमर के गतिशील संस्करणों के साथ एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समन्वय के परख दिखाए। यह एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं के बीच आकस्मिक लिंकिंग तंत्र को रोक सकता है। यहां, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी-आधारित इन विट्रो पुनर्गठन तकनीक एक जैव रासायनिक प्रतिक्रिया से एक्टिन और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता दोनों के दृश्य की अनुमति देती है। यह तकनीक व्यक्तिगत रूप से या अन्य बहुलक की उपस्थिति में एक्टिन फिलामेंट या सूक्ष्मनलिकाएं की पोलीमराइजेशन गतिशीलता को संरक्षित करती है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ताऊ प्रोटीन का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है कि क्लासिक साइटोस्केलेटल क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन की उपस्थिति में एक्टिन-सूक्ष्मनलिका व्यवहार कैसे बदलते हैं। यह विधि विश्वसनीय कार्यात्मक और यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है कि व्यक्तिगत नियामक प्रोटीन एकल फिलामेंट्स या उच्च-क्रम परिसरों के संकल्प पर एक्टिन-सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का समन्वय कैसे करते हैं।

Introduction

ऐतिहासिक रूप से, एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं अलग-अलग संस्थाओं के रूप में देखी गई हैं, जिनमें से प्रत्येक नियामक प्रोटीन, गतिशीलता व्यवहार और अलग-अलग सेलुलर स्थानों के अपने सेट के साथ है। प्रचुर मात्रा में सबूत अब दर्शाते हैं कि एक्टिन और सूक्ष्मनलिका पॉलिमर कार्यात्मक क्रॉसस्टॉक तंत्र में संलग्न हैं जो माइग्रेशन, माइटोटिक स्पिंडल पोजिशनिंग, इंट्रासेल्युलर ट्रांसपोर्ट और सेल आकृति विज्ञान 1,2,3,4 सहित कई सेल प्रक्रियाओं को निष्पादित करने के लिए आवश्यक हैं। इन उदाहरणों को रेखांकित करने वाले विविध समन्वित व्यवहार युग्मन कारकों, संकेतों और भौतिक गुणों के जटिल संतुलन पर निर्भर हैं। हालांकि, इन तंत्रों को रेखांकित करने वाले आणविक विवरण अभी भी काफी हद तक अज्ञात हैं क्योंकि अधिकांश अध्ययन एक समय 1,2,5 पर एक एकल साइटोस्केलेटल बहुलक पर ध्यान केंद्रित करते हैं।

एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं सीधे 6,7,8 से बातचीत नहीं करती हैं। कोशिकाओं में देखी गई एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं की समन्वित गतिशीलता अतिरिक्त कारकों द्वारा मध्यस्थता की जाती है। एक्टिन-माइक्रोट्यूब्यूल क्रॉसस्टॉक को विनियमित करने के लिए सोचे गए कई प्रोटीनों की पहचान की गई है और उनकी गतिविधियों को अकेले साइटोस्केलेटल बहुलक 1,2 के संबंध में अच्छी तरह से विशेषता है। बढ़ते सबूत बताते हैं कि इस एकल बहुलक दृष्टिकोण ने कुछ प्रोटीन / परिसरों के दोहरे कार्यों को छुपाया है जो एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन घटनाओं को सक्षम करते हैं 7,8,9,10,11,12,13। प्रयोग जहां दोनों पॉलिमर मौजूद हैं दुर्लभ हैं और अक्सर अन्य 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 के एकल गतिशील बहुलक और स्थैतिक स्थिर संस्करण के साथ तंत्र को परिभाषित करते हैं . इस प्रकार, एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समन्वय प्रोटीन के आकस्मिक गुणों की जांच करने के लिए तरीकों की आवश्यकता होती है जो केवल प्रयोगात्मक प्रणालियों में पूरी तरह से समझा जा सकता है जो दोनों गतिशील पॉलिमर को नियोजित करते हैं।

प्रत्यक्ष प्रोटीन लेबलिंग दृष्टिकोण, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड आत्मीयता टैग, और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का संयोजन बायोमिमेटिक पुनर्गठन प्रणालियों 19,20,21,22,23 में बड़ी सफलता के साथ लागू किया गया है। कई बॉटम-अप योजनाओं में वे सभी कारक नहीं होते हैं जो कोशिकाओं में प्रोटीन को विनियमित करते हैं। हालांकि, “कवरग्लास पर जैव रसायन” तकनीक ने उच्च स्थानिक और लौकिक तराजू पर एक्टिन और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के कई तंत्रों को परिष्कृत किया है, जिसमें बहुलक असेंबली या विघटन के लिए आवश्यक घटक और मोटर प्रोटीन आंदोलन 5,12,23,24,25,26,27 शामिल हैं . यहां इन विट्रो में एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन की जांच के लिए एक न्यूनतम घटक एकल-फिलामेंट दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या अत्यधिक शुद्ध शुद्ध प्रोटीन, फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन, छिड़काव कक्षों के साथ किया जा सकता है, और सेल अर्क या सिंथेटिक सिस्टम युक्त अधिक जटिल योजनाओं तक बढ़ाया जा सकता है। यहां, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ताऊ प्रोटीन का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है कि एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन प्रोटीन की उपस्थिति में साइटोस्केलेटल गतिशीलता कैसे बदलती है, लेकिन इसे अन्य पुटेटिव एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समन्वय कारकों के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। अन्य दृष्टिकोणों पर इस प्रणाली का प्रमुख लाभ एक प्रतिक्रिया में कई साइटोस्केलेटल पॉलिमर की गतिशीलता की एक साथ निगरानी करने की क्षमता है। यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को साइटोस्केलेटल पॉलिमर में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए उदाहरण और सरल उपकरण भी प्रदान करता है। इस प्रकार, प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता तंत्र का वर्णन करने के लिए विश्वसनीय, मात्रात्मक, एकल-फिलामेंट रिज़ॉल्यूशन डेटा का उत्पादन करेंगे जो इस बात को रेखांकित करते हैं कि विविध नियामक प्रोटीन एक्टिन-सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का समन्वय कैसे करते हैं।

Protocol

1. कवरलिप्स को धोना नोट: स्मिथ एट अल, 201328 के अनुसार धोएं (24 मिमी x 60 मिमी, # 1.5) कवरलिप्स। प्लास्टिक स्लाइड मेलर कंटेनर में कवरलिप्स व्यवस्थित करें। निम्नलिखित समाधानों में क्रमिक रूप से कवरलिप्स को डुबोएं और 30-60 मिनट के लिए सोनिकेट करें, प्रत्येक समाधान के बीच में डीडीएच2ओ 10 बार कुल्ला करें: डिश साबुन की एक बूंद के साथ डीडीएच2ओ; 0.1 एम केओएच। 6 महीने तक 100% इथेनॉल में कवरलिप्स स्टोर करें।नोट: उंगलियों के साथ कांच की सतहों को स्पर्श न करें। इसके बजाय संदंश का प्रयोग करें। 2. कोटिंग साफ (24 मिमी x 60 मिमी, # 1.5) एमपीईजी- और बायोटिन-पीईजी-सिलेन के साथ कवरलिप्स नोट: यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से टीआईआरएफ इमेजिंग विमान के भीतर एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं स्थिति के लिए बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन सिस्टम का उपयोग करता है। अन्य कोटिंग्स और प्रणालियों का उपयोग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी, पॉली-एल-लाइसिन, एनईएम मायोसिन, आदि)। खूंटी-सिलेन और बायोटिन-पीईजी-सिलेन पाउडर के पिघलना विभाज्य। उपयोग से ठीक पहले 10 मिलीग्राम / एमएल एमपीईजी-सिलेन और 2-4 मिलीग्राम / एमएल बायोटिन-पीईजी-सिलेन के कोटिंग स्टॉक समाधान उत्पन्न करने के लिए 80% इथेनॉल (पीएच 2.0) में खूंटी पाउडर को भंग करें।नोट: खूंटी पाउडर अक्सर भंग दिखाई देते हैं लेकिन सूक्ष्म स्तर पर नहीं हो सकते हैं। उचित पुन: निलंबन निरंतर पाइपिंग के साथ ~ 1-2 मिनट लेता है। उपयोगकर्ताओं को पाउडर विघटन की उपस्थिति के बाद अतिरिक्त 10 बार पिपेट करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है।सावधानी: 80% इथेनॉल (पीएच 2.0) बनाते समय केंद्रित एचसीएल से त्वचा की रक्षा के लिए दस्ताने पहनें। संदंश का उपयोग इथेनॉल भंडारण से साफ (24 मिमी x 60 मिमी, # 1.5) कवरस्लिप निकालें। नाइट्रोजन गैस के साथ सूखें और एक साफ पेट्री डिश में स्टोर करें। कोट कोटिंग समाधान के 100 μL के साथ कवरलिप्स: 80% इथेनॉल (पीएच 2.0) में 2 मिलीग्राम / एमएल एमपीईजी-सिलेन (मेगावाट 2,000) और 0.04 मिलीग्राम / एमएल बायोटिन-पीईजी-सिलेन (मेगावाट 3,400) का मिश्रण।नोट: विरल कोटिंग (अनुशंसित) के लिए 2 मिलीग्राम / एमएल एमपीईजी-सिलेन और 0.04 मिलीग्राम / एमएल बायोटिन-पीईजी-सिलेन का उपयोग करें। घने कोटिंग के लिए 2 मिलीग्राम / एमएल एमपीईजी-सिलेन, 4 मिलीग्राम / एमएल बायोटिन-पीईजी-सिलेन का उपयोग करें। कम से कम 18 घंटे के लिए या उपयोग होने तक 70 डिग्री सेल्सियस पर कवरलिप्स सेते हैं।नोट: लेपित कवरलिप्स नीचा दिखाते हैं यदि 2 सप्ताह से अधिक समय तक 70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। 3. इमेजिंग प्रवाह कक्षों को इकट्ठा करना डबल-समर्थित डबल-पक्षीय टेप के 12 स्ट्रिप्स को 24 मिमी की लंबाई तक काटें। टेप बैकिंग के एक तरफ निकालें और एक साफ इमेजिंग चैंबर पर मौजूद छह खांचे से सटे टेप के टुकड़ों को ठीक करें।नोट: टेप उचित विधानसभा के लिए फ्लैट होना चाहिए, अन्यथा इमेजिंग कक्ष लीक हो जाएगा। धक्कों से बचने के लिए टेप बैकिंग को सावधानीपूर्वक हटा दें। टेप-चैंबर संपर्कों को चिकनी करने के लिए एक साफ सतह पर टेप किए गए कक्षों को फिसलने की सिफारिश की जाती है। प्रत्येक कक्ष नाली के साथ टेप के चिपचिपा पक्ष को उजागर करने के लिए टेप बैकिंग के दूसरे टुकड़े को हटा दें। एक साफ सतह पर चैंबर टेप पक्ष रखें। एक छोटी वजन नाव में एपॉक्सी राल और हार्डनर समाधान 1: 1 (या निर्माता के निर्देशों के अनुसार) मिलाएं। प्रत्येक इमेजिंग चैंबर नाली (लाल तीर) के अंत में टेप स्ट्रिप्स के बीच मिश्रित एपॉक्सी की एक बूंद रखने के लिए एक पी 1000 टिप का उपयोग करें; चित्रा 1 ए)। एक साफ सतह पर चैंबर टेप / एपॉक्सी पक्ष रखें। 70 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से एक लेपित कवरस्लिप निकालें। डीडीएच2ओ छह बार के साथ कवरलिप्स की लेपित और अनकोटेड सतहों को कुल्ला, फ़िल्टर्ड नाइट्रोजन गैस के साथ सूखा, और फिर टेप की ओर कवरस्लिप कोटिंग पक्ष के साथ इमेजिंग कक्ष में चिपकाएं। टेप और कवरस्लिप के बीच एक अच्छी मुहर सुनिश्चित करने के लिए टेप-ग्लास इंटरफ़ेस पर दबाव लागू करने के लिए एक पी 200 या पी 1000 पिपेट टिप का उपयोग करें।नोट: एक उचित मुहर के साथ, डबल पक्षीय टेप पारदर्शी हो जाता है। पर्याप्त टेप-कक्ष संपर्कों की कमी वाले इमेजिंग कक्ष लीक हो जाएंगे। उपयोग करने से पहले एपॉक्सी को पूरी तरह से सील कक्ष कुओं की अनुमति देने के लिए कम से कम 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इकट्ठे कक्षों सेते हैं। छिड़काव कक्ष विधानसभा के 12-18 घंटे के भीतर समाप्त हो जाते हैं।नोट: टेप प्लेसमेंट और उपयोग किए गए डबल-पक्षीय टेप की मोटाई के आधार पर, इकट्ठे कक्ष में 20-50 μL की अंतिम मात्रा होगी। 4. छिड़काव कक्षों की कंडीशनिंग छिड़काव कक्ष में क्रमिक रूप से कंडीशनिंग समाधान का आदान-प्रदान करने के लिए एक छिड़काव पंप (500 μL / मिनट के लिए सेट दर) का उपयोग करें: इमेजिंग कक्ष को प्राइम करने के लिए 1% बीएसए के 50 μL प्रवाह। लुअर लॉक फिटिंग जलाशय से अतिरिक्त बफर निकालें। 0.005 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टाविडिन के 50 μL प्रवाह। कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट के लिए सेते हैं। जलाशय से अतिरिक्त बफर निकालें। निरर्थक बाध्यकारी ब्लॉक करने के लिए 1% बीएसए के 50 μL प्रवाह। 10-30 एस के लिए सेते हैं। जलाशय से अतिरिक्त बफर निकालें। गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) 1 एक्स टीआईआरएफ बफर (1 एक्स बीआरबी 80, 50 एमएम केसीएल, 10 एमएम डीटीटी, 40 एमएम ग्लूकोज, 0.25% (वी / वी) मिथाइलसेल्यूलोज (4,000 सीपी)) के प्रवाह।नोट: जलाशय से अतिरिक्त बफर न निकालें। यह कक्ष को सूखने से रोकता है, जो सिस्टम में हवा के बुलबुले पेश कर सकता है। वैकल्पिक: 1x TIRF बफर में पतला स्थिर29 और 50% बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिका बीज के 50 μL प्रवाह।नोट: उचित कमजोर पड़ने अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए और बैच परिवर्तनशीलता के लिए बैच शामिल होना चाहिए। 27,29 से प्रोटोकॉल प्रारंभिक बिंदुओं के रूप में अनुशंसित हैं। दृश्य के प्रति क्षेत्र 10-30 बीज पैदा करने वाला कमजोर पड़ना इस सेटअप के साथ अच्छी तरह से काम करता है। 5. माइक्रोस्कोप तैयारी नोट: गतिशील एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं युक्त जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं को 120-150 मेगावाट ठोस-राज्य लेजर, एक तापमान सही 63x तेल विसर्जन टीआईआरएफ उद्देश्य और एक ईएमसीसीडी कैमरा से लैस एक उल्टे कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना / इस उदाहरण में प्रोटीन को निम्नलिखित तरंग दैर्ध्य पर देखा जाता है: 488 एनएम (सूक्ष्मनलिकाएं) और 647 एनएम (एक्टिन)। उद्देश्य हीटर डिवाइस को पहली जैव रासायनिक प्रतिक्रिया इमेजिंग से पहले कम से कम 30 मिनट में 35-37 डिग्री सेल्सियस बनाए रखने के लिए सेट करें। छवि अधिग्रहण पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: 15-20 मिनट के लिए हर 5 एस के लिए अधिग्रहण अंतराल सेट करें। 5% -10% शक्ति पर 50-100 एमएस के लिए 488 और 647 लेजर एक्सपोजर सेट करें। माइक्रोस्कोप के लिए उपयुक्त टीआईआरएफ कोण सेट करें।नोट: माइक्रोस्कोप सेटअप के बावजूद, लेजर पावर, एक्सपोज़र और टीआईआरएफ कोण सेट करने का सबसे आसान तरीका अकेले बहुलक की छवियों पर समायोजन करना है (नीचे 5.2.2.1 और 5.2.2.2 देखें)। उपयोगकर्ताओं को सबसे कम लेजर पावर और एक्सपोज़र सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए दृढ़ता से प्रोत्साहित किया जाता है जो अभी भी पता लगाने की अनुमति देते हैं। एक्टिन फिलामेंट असेंबली शुरू करने और 647 एनएम पर छवियों को प्राप्त करने के लिए पोलीमराइजेशन प्रतिक्रिया (चित्रा 1 सी) समायोजित करें। उचित समायोजन करें। सूक्ष्मनलिकाएं विधानसभा (चित्रा 1 सी) शुरू करने और 488 एनएम पर कल्पना करने के लिए एक दूसरे वातानुकूलित छिड़काव में पोलीमराइजेशन प्रतिक्रिया को अच्छी तरह से समायोजित करें। उचित समायोजन करें। 6. प्रोटीन प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ट्यूबुलिन का स्टॉक समाधान तैयार करें। एबीएस280 पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के माध्यम से घर का बना बिना लेबल वाले ट्यूबुलिन की एकाग्रता का निर्धारण करें, निम्नानुसार: 1xBRB80 के साथ खाली स्पेक्ट्रोफोटोमीटर जीटीपी की कमी है। 115,000 एम – 1 सेमी – 1 के निर्धारित विलुप्त होने गुणांक और निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके ट्यूबुलिन की एकाग्रता की गणना करें: व्यावसायिक रूप से निर्मित लियोफिलाइज्ड लाइसिन-लेबल वाले 488-ट्यूबुलिन को 10 μM (1 मिलीग्राम / एमएल; 100% लेबल) के साथ 1x BRB80 के 20 μL के साथ जीटीपी की कमी है। बर्फ पर 100 μM अनलेबल पुनर्नवीनीकरण ट्यूबुलिन29 के 7.2 μL विभाज्य पिघलना।नोट: पुनर्नवीनीकरण ट्यूबुलिन इन विट्रो में सफल सूक्ष्मनलिका असेंबली के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह जमे हुए प्रोटीन स्टॉक29,30 में गठित पोलीमराइजेशन-अक्षम डिमर्स को हटा देता है। 10 μM 488-ट्यूबुलिन के 3 μL को 100 μM अनलेबल ट्यूबुलिन के 7.2 μL विभाज्य के साथ मिलाएं, उपयोग करने से पहले 15 मिनट से अधिक नहीं। फ्लोरोसेंटली लेबल एक्टिन का स्टॉक समाधान तैयार करें। घर का बना प्रोटीन के लिए, स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री एबीएस290 और एबीएस650 के माध्यम से एक्टिन की एकाग्रता और प्रतिशत लेबल निर्धारित करें, निम्नानुसार: जी-बफर के साथ रिक्त स्पेक्ट्रोफोटोमीटर। 25,974 एम -1 सेमी -1 के निर्धारित विलुप्त होने गुणांक और निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके बिना लेबल वाले एक्टिन की एकाग्रता की गणना करें: बिना लेबल वाले एक्टिन के विलुप्त होने गुणांक, 0.03 के फ्लोर सुधार कारक और निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके एलेक्सा -647-एक्टिन लेबल वाले लाइसिन की एकाग्रता की गणना करें:[एलेक्सा -647 एक्टिन], μM = (एबीएस290 – 239,000 एम -1 सेमी -1 के एलेक्सा -647 के लिए निर्धारित ε का उपयोग करके एलेक्सा -647-एक्टिन के प्रतिशत लेबल की गणना करें, निम्नानुसार:एलेक्सा -647-एक्टिन का % लेबल = (एबीएस290 – ( 3 μM 100% लेबल बायोटिन-एक्टिन (लाइसिन अवशेषों पर लेबल) के एक 2 μL विभाज्य पिघलना। जी-बफर के 18 μL जोड़कर 10 गुना पतला करें। पतला बायोटिनिलेटेड एक्टिन के 3 μL को मिलाएं, बिना लेबल वाले और लेबल वाले एक्टिन (ऊपर) की उचित मात्रा जैसे कि अंतिम मिश्रण 10% -30% फ्लोरोसेंट लेबल के साथ 12.5 μM कुल एक्टिन होगा।नोट: 30% प्रतिशत से अधिक फ्लोरोसेंट एक्टिन मोनोमर्स (अंतिम) इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन से समझौता कर सकते हैं क्योंकि फिलामेंट्स पृष्ठभूमि से समझना मुश्किल हो जाता है। प्रतिक्रिया घोला जा सकता है (चित्रा 1 सी) तैयार करें। ट्यूबुलिन स्टॉक मिश्रण (6.1.4) के साथ 12.5 μM एक्टिन मिश्रण स्टॉक (6.2.3) के 2 μL के संयोजन से साइटोस्केलेटन मिश्रण (ट्यूब ए) तैयार करें, इमेजिंग से पहले 15 मिनट से अधिक नहीं। उपयोग होने तक बर्फ पर स्टोर करें। अन्य सभी प्रयोगात्मक घटकों और प्रोटीन के संयोजन से प्रोटीन प्रतिक्रिया मिश्रण (ट्यूब बी) तैयार करें, जिनमें शामिल हैं: 2x TIRF बफर, एंटी-ब्लीच, न्यूक्लियोटाइड, बफर और गौण प्रोटीन। एक उदाहरण चित्रा 1 सी में दिखाया गया है।नोट: अंतिम कमजोर पड़ने के परिणामस्वरूप 1x TIRF बफर होता है जिसमें अनुमानित शारीरिक सीमा के भीतर एटीपी, जीटीपी और आयनिक ताकत होती है। 30-60 एस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अलग से ट्यूब ए और ट्यूब बी सेते हैं। प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए, ट्यूब बी की सामग्री को ट्यूब ए (नीचे) में मिलाएं और जोड़ें। 7. छवि एक्टिन और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता हालत छिड़काव अच्छी तरह से (चित्रा 1 बी; चरण 4, ऊपर)। ट्यूब ए (साइटोस्केलेटन मिश्रण) (चित्रा 1 सी) में ट्यूब बी (प्रतिक्रिया मिश्रण) की सामग्री को जोड़कर एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं असेंबली एक साथ शुरू करें। 15 μM मुक्त ट्यूबुलिन, 1 एमएम जीटीपी, और 0.5 μM एक्टिन मोनोमर्स और बफर नियंत्रण की उचित मात्रा के साथ पूरक 1x TIRF बफर युक्त प्रतिक्रिया के प्रवाह 50 μL। 15-20 मिनट के लिए हर 5 एस प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रिकॉर्ड समय चूक फिल्म।नोट: एक्टिन और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता की दीक्षा 2-5 मिनट (चित्रा 2) के भीतर होती है। लंबे समय तक देरी तापमान नियंत्रण या प्रतिक्रिया मिश्रण में प्रोटीन की एकाग्रता से संबंधित समस्याओं के साथ समस्याओं का संकेत देती है। एक नया छिड़काव अच्छी तरह से शर्त (चरण 4) और ब्याज के नियामक प्रोटीन (ओं) (यानी, ताऊ) और बफर नियंत्रण (चित्रा 1 सी) के साथ बफर मात्रा की जगह। आकस्मिक एक्टिन-सूक्ष्मनलिका कार्यों के लिए नियामक प्रोटीन का आकलन करने के लिए चरण 7 (ऊपर) में उल्लिखित के रूप में प्राप्त करें। 8. फिजी सॉफ्टवेयर 31 का उपयोग करके छवियों को संसाधित और विश्लेषणकरें सहेजी गई टीआईआरएफ फिल्में खोलें और समग्र के रूप में देखें। सूक्ष्मनलिका गतिशीलता (चित्रा 3 ए) का विश्लेषण करें, निम्नानुसार है: छवि स्टैक मेनू से एक समय-आधारित अधिकतम जेड-प्रक्षेपण उत्पन्न करें। विश्लेषण> उपकरण> सिंक्रनाइज़ Windows मेनू से मूल TIRF चलचित्र के साथ Z-प्रोजेक्शन विंडो सिंक्रनाइज़ करें। समय अनुमानित छवि पर ब्याज की सूक्ष्मनलिका के साथ सीधी रेखा उपकरण का उपयोग करके एक रेखा खींचें। विश्लेषण मेनू (विश्लेषण> उपकरण> आरओआई प्रबंधक) से ब्याज (आरओआई) प्रबंधक का क्षेत्र खोलें। “टी” दबाकर व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिका स्थानों को सहेजें। ब्याज के सभी सूक्ष्मनलिकाएं के लिए दोहराएं। “/” का उपयोग करके चयनित लाइनों के काइमोग्राफ प्लॉट करें या मल्टी-काइमो मैक्रो चलाएं जो आरओआई प्रबंधक31 में प्रत्येक सूक्ष्मनलिका के लिए एक वीडियो और काइमोग्राफ उत्पन्न करता है। विश्लेषण> उपकरण> स्केल पट्टियाँ मेनू से काइमोग्राफ़ में लंबाई (μm) और समय (मिनट) स्केल पट्टियाँ दोनों जोड़ें। काइमोग्राफ ढलानों से सूक्ष्मनलिका विकास की गति को मापें (चित्रा 3 ए, 1-2; काली रेखाओं की ढलान)। उत्पन्न काइमोग्राफ से गतिशील सूक्ष्मनलिका घटनाओं (तबाही या पुनर्विकास) की गणना करें या उपलब्ध विश्लेषण मैक्रोज़ 5,8,18,25 का उपयोग करें। चित्रा 3 ए, 1-2 में लाल बिंदीदार रेखाएं तबाही / एक्टिन गतिशीलता (चित्रा 3 बी) का विश्लेषण करें, निम्नानुसार: एक्टिन न्यूक्लिएशन को मापें, निम्नानुसार: प्रतिक्रिया की दीक्षा के बाद दृश्य 100 एस के क्षेत्र में मौजूद एक्टिन फिलामेंट्स की संख्या की गणना करें और क्षेत्र (फिलामेंट्स प्रति μm2) द्वारा व्यक्त करें। आरओआई प्रबंधक में डेटा रिकॉर्ड करें और सहेजें, जैसा कि ऊपर चरण 8.2.3.1 में है। एक्टिन फिलामेंट बढ़ाव दर (चित्रा 3 बी) को मापें, निम्नानुसार: खंडित-रेखा उपकरण का उपयोग करके ब्याज के एक्टिन फिलामेंट के साथ एक रेखा खींचें। ऊपर चरण 8.2.3.1 के रूप में आरओआई प्रबंधक को लाइन जोड़ें। कम से कम चार मूवी फ्रेम के लिए लाइन (आरओआई प्रबंधक में प्रत्येक माप जोड़ना) का पालन करें।नोट: लगातार सात से आठ फ्रेम को मापने की सिफारिश की जाती है, हालांकि कुछ स्थितियां पता लगाने योग्य सीमा से नीचे एक्टिन पोलीमराइजेशन को धीमा कर देती हैं जिन्हें उद्देश्य / माइक्रोस्कोप सेटअप द्वारा हल किया जा सकता है। ऐसे मामले में, गैर-लगातार फ्रेम पर नियमित अंतराल पर माप किया जा सकता है, (उदाहरण के लिए, हर पांच फ्रेम)। प्लॉट ने बीत चुके समय पर लंबाई मूल्यों को मापा। उत्पन्न लाइन की ढलान माइक्रोन / एस में एक्टिन बढ़ाव दर है। फिलामेंट32 के माइक्रोन में एक्टिन मोनोमर्स की संख्या के लिए खाते में 370 सबयूनिट्स के सुधार कारक का उपयोग करके सबयूनिट्स एस -1 μM-1 के रूप में अंतिम गणना दरों को व्यक्त करें। समानांतर एक्टिन-सूक्ष्मनलिका संघ (चित्रा 3 सी) के क्षेत्रों के लिए सहसंबंधी विश्लेषण करें, निम्नानुसार: सीधी रेखा उपकरण का उपयोग करके एक विशिष्ट समय बिंदु (यानी, प्रतिक्रिया दीक्षा के बाद 300 एस) पर ब्याज की सूक्ष्मनलिका के साथ एक रेखा खींचें। ऊपर चरण 8.2.3.1 के रूप में आरओआई प्रबंधक को लाइन जोड़ें। प्रत्येक चैनल में लाइन के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता प्लॉट करें। छवि स्लाइडर के साथ प्रत्येक चैनल का चयन करें और “कमांड के” का उपयोग करके लाइन के साथ तीव्रता को प्लॉट करें। आउटपुट विंडो में “सूची” बटन पर क्लिक करके मान सहेजें या निर्यात करें। व्यक्तिगत घटनाओं से अनुपात (सूक्ष्मनलिकाएं के साथ एक्टिन अतिव्यापी) के रूप में या एक सुसंगत समय बिंदु (चित्रा 3 सी) पर देखने के किसी दिए गए क्षेत्र में घटनाओं की गिनती के रूप में एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन घटनाओं को व्यक्त करें। वैकल्पिक: दोनों चैनलों 5,12 के प्रतिशत ओवरलैप को निर्धारित करने के लिए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।

Representative Results

ऊपर वर्णित शर्तों (चित्रा 1) के साथ, एक्टिन और सूक्ष्मनलिका पॉलिमर छवि अधिग्रहण (चित्रा 2) के 2 मिनट के भीतर दृश्यमान (और गतिशील) होना चाहिए। किसी भी जैव रसायन-आधारित प्रोटोकॉल के साथ, विभिन्न नियामक प्रोटीन या प्रोटीन के बैचों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इन कारणों से, टीआईआरएफ कोण और छवि एक्सपोजर प्रत्येक व्यक्तिगत बहुलक युक्त प्रतिक्रियाओं के साथ पहले सेट किए जाते हैं। यह पुष्टि करता है कि संग्रहीत प्रोटीन कार्यात्मक हैं और पता लगाने के लिए पर्याप्त लेबल प्रोटीन मौजूद है। जबकि हमेशा आवश्यक नहीं है (और यहां प्रदर्शन नहीं किया गया है), फिल्मों के पोस्ट-प्रोसेसिंग (यानी, पृष्ठभूमि घटाव, औसत, या फूरियर परिवर्तन) का उपयोग छवि विपरीत (विशेष रूप से सूक्ष्मनलिकाएं) 5,25,33 को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। इस परख द्वारा प्रदान किए गए एकल एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं का प्रत्यक्ष दृश्य या तो साइटोस्केलेटन घटक के लिए कई गतिशील उपायों के मात्रात्मक निर्धारण का समर्थन करता है, जिसमें पोलीमराइजेशन पैरामीटर (यानी, न्यूक्लिएशन या बढ़ाव दर), विघटन पैरामीटर (यानी, संकोचन दर या तबाही की घटनाएं), और बहुलक कोलिग्नमेंट / ). इसके अलावा, इन उपायों का उपयोग ताऊ (चित्रा 3) जैसे नियामक लिगेंड के बंधन या प्रभाव को समझने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में किया जा सकता है। एकल एक्टिन फिलामेंट्स या सूक्ष्मनलिकाएं के कई माप एक टीआईआरएफ फिल्म से किए जा सकते हैं। हालांकि, कवरस्लिप कोटिंग, पाइपिंग और अन्य कारकों में भिन्नता के कारण, विश्वसनीय माप में कई तकनीकी प्रतिकृति प्रतिक्रियाएं / सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के कई पहलुओं को उदाहरण केमोग्राफ से निर्धारित किया जा सकता है जिसमें सूक्ष्मनलिकाएं बढ़ाव की दर, साथ ही तबाही और बचाव की घटनाओं (चित्रा 3 ए) की आवृत्ति शामिल है। इस प्रणाली में एक्टिन गतिशीलता को मापने के लिए काइमोग्राफ का उपयोग करना उतना सीधा नहीं है क्योंकि एक्टिन फिलामेंट्स सूक्ष्मनलिकाएं की तुलना में अधिक जटिल हैं। नतीजतन, एक्टिन फिलामेंट गतिशीलता के मापदंडों को हाथ से मापा जाता है, जो समय लेने वाली और श्रम गहन है। न्यूक्लिएशन काउंट को सभी स्थितियों के लिए एक सुसंगत समय बिंदु पर मौजूद एक्टिन फिलामेंट्स की संख्या के रूप में मापा जाता है। ये गिनती टीआईआरएफ इमेजिंग क्षेत्रों में व्यापक रूप से भिन्न होती है, लेकिन इसका उपयोग कई प्रतिकृतियों के साथ या अन्य पोलीमराइजेशन परखों से टिप्पणियों के पूरक के लिए किया जा सकता है। न्यूक्लिएशन काउंट का उपयोग सूक्ष्मनलिकाएं के लिए भी किया जा सकता है यदि परीक्षण की स्थिति में स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं बीज की कमी होती है। एक्टिन फिलामेंट बढ़ाव दरों को कम से कम चार फिल्म फ्रेम से समय के साथ फिलामेंट की लंबाई के रूप में मापा जाता है। फिलामेंट (चित्रा 3 बी) 32 के माइक्रोन में एक्टिन मोनोमर्स की संख्या के लिए खाते में 370 सबयूनिट्स के सुधार कारक के साथ दर मूल्यों को प्रति माइक्रोमोलर एक्टिन व्यक्त किया जाता है। एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं के बीच समन्वित व्यवहार को परिभाषित करने के लिए माप कम अच्छी तरह से परिभाषित हैं। हालांकि, लाइन स्कैन (चित्रा 3 सी) या ओवरलैप सॉफ्टवेयर 5,11,34 सहित दोनों पॉलिमरके संयोग को मापने के लिए सहसंबंधी विश्लेषण लागू किए गए हैं। डेटा उपलब्धता:इस काम से जुड़े सभी डेटासेट ज़ेनोडो में जमा किए गए हैं और उचित अनुरोध के साथ उपलब्ध हैं: 10.5281 / चित्र 1. प्रायोगिक योजनाबद्धता: छवि अधिग्रहण के लिए प्रवाह कक्ष विधानसभा। (ए) इमेजिंग चैंबर असेंबली। ऊपर से नीचे: आईबीआईडीआई इमेजिंग कक्षों को छिड़काव कुओं (तीर द्वारा निरूपित) के साथ टेप किया जाता है; टेप बैकिंग की दूसरी (सफेद) परत (बेहतर उन्मुख उपयोगकर्ताओं को दिखाई गई छवि में छोड़ दिया गया है) को हटा दिया जाता है और एपॉक्सी को छिड़काव कक्ष (तीर) के किनारे पर लागू किया जाता है। नोट: उपयोगकर्ताओं को अधिक आसानी से उन्मुख करने के लिए जहां एपॉक्सी रखना है, इस छवि में सफेद बैकिंग छोड़ दी गई थी। साफ और लेपित कवरस्लिप कोटिंग पक्ष के साथ इमेजिंग कक्ष से जुड़ा हुआ है जो छिड़काव के अंदर अच्छी तरह से सामना कर रहा है। (बी) बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन लिंकेज के लिए कंडीशनिंग इमेजिंग कक्षों के लिए चरणों को दर्शाते हुए फ्लो-चार्ट। (सी) गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन फिलामेंट्स की टीआईआरएफ फिल्मों को प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रतिक्रियाओं के उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्र 2. ताऊ की अनुपस्थिति या उपस्थिति में बढ़ते एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं के छवि अनुक्रम। 250 एनएम ताऊ की अनुपस्थिति (ए) या उपस्थिति (बी) में 0.5 μM एक्टिन (10% एलेक्सा-647-एक्टिन और 0.09% बायोटिन-एक्टिन लेबल) और 15 μM मुक्त ट्यूबुलिन (4% HiLyte-488 लेबल) युक्त TIRF परख से समय चूक छवि असेंबल। प्रतिक्रिया दीक्षा (ट्यूब ए और ट्यूब बी मिश्रण) से बीता हुआ समय दिखाया गया है। स्केल सलाखों, 25 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 3. सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन फिलामेंट गतिशीलता के उदाहरण माप। (ए) ट्यूबुलिन चैनल का औसत समय प्रक्षेपण कुशलतापूर्वक काइमोग्राफ भूखंडों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली लाइन स्कैन के लिए कुल सूक्ष्मनलिकाएं लंबाई की कल्पना करता है। काली बिंदीदार रेखाएं दाईं ओर दिखाए गए गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं के दो उदाहरण के अनुरूप हैं। सूक्ष्मनलिकाएं की वृद्धि (ठोस काली रेखाएं) और विघटन चरण (डॉटेड गुलाबी रेखाएं; गुलाबी तीर के साथ दो निरूपित) प्रत्येक काइमोग्राफ पर दिखाए जाते हैं। समय स्केल बार, 3 मिनट। लंबाई स्केल बार, 10 μm. प्रतिक्रिया में 0.5 μM एक्टिन (10% 647-लेबल) और 15 μM मुक्त ट्यूबुलिन (4% 488-हाइलाइट लेबल) शामिल हैं। केवल ट्यूबुलिन चैनल दिखाया गया है। (बी) दो उदाहरण समय चूक छवि असेंबल एकल-एक्टिन फिलामेंट्स को सक्रिय रूप से पोलीमराइज़िंग का चित्रण करते हैं। बढ़ाव दरों की गणना प्रति माइक्रोमोलर एक्टिन समय के साथ एक्टिन फिलामेंट्स की लंबाई के भूखंडों की ढलान के रूप में की जाती है। इस प्रकार, आमतौर पर 1 μM एक्टिन एकाग्रता पर निर्धारित दरों की तुलना के लिए दो का एक सुधार कारक 0.5 μM एक्टिन प्रतिक्रियाओं पर लागू किया जाना चाहिए। पांच फिलामेंट्स के उदाहरण दाईं ओर दिखाए गए हैं। स्केल सलाखों, 10 μm. प्रतिक्रिया में 0.5 μM एक्टिन (10% 647-लेबल) और 15 μM मुक्त ट्यूबुलिन (4% 488-हाइलाइट लेबल) शामिल हैं। केवल एक्टिन चैनल दिखाया गया है। (सी) गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं (एमटी) (हरा) और एक्टिन फिलामेंट्स (बैंगनी) की टीआईआरएफ छवियां अनुपस्थिति (बाएं) या 250 एनएम ताऊ (मध्य) की उपस्थिति में पोलीमराइजिंग। नीली बिंदीदार रेखाएं और तीर चिह्नित करते हैं जहां प्रत्येक स्थिति (प्रत्येक छवि के नीचे) के अनुरूप लाइन स्कैन भूखंडों के लिए एक रेखा खींची गई थी। सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन क्षेत्रों (काले रंग के रूप में दिखाया गया है) के बीच ओवरलैप को प्रति क्षेत्र (दाएं) एक निर्धारित समय बिंदु पर स्कोर किया जा सकता है। स्केल सलाखों, 25 μm. प्रतिक्रियाओं में 0.5 μM एक्टिन (10% 647-लेबल) और 15 μM मुक्त ट्यूबुलिन (4% 488-HiLyite लेबल) 250 एनएम ताऊ के साथ या बिना होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग शुद्ध प्रोटीन के लिए साइटोस्केलेटल विनियमन 5,23,24,25,26,27,35 के अद्वितीय तंत्र को विच्छेदित करने के लिए एक उपयोगी और सम्मोहक दृष्टिकोण रहा है। पारंपरिक जैव रासायनिक परखों की तुलना में, टीआईआरएफ प्रतिक्रियाओं को बहुत कम मात्रा (50-100 μL) की आवश्यकता होती है, और साइटोस्केलेटल गतिशीलता के मात्रात्मक माप को एक व्यक्तिगत परख से प्राप्त किया जा सकता है। साइटोस्केलेटल गतिशीलता के अधिकांश अध्ययन एक एकल बहुलक प्रणाली (यानी, एक्टिन फिलामेंट्स या सूक्ष्मनलिकाएं) पर ध्यान केंद्रित करते हैं, इस प्रकार आमतौर पर कोशिकाओं में देखे जाने वाले एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं के बीच क्रॉसस्टॉक या आकस्मिक व्यवहार के विस्तृत माप मायावी और टेस्ट ट्यूब में पुनरावृत्ति करना मुश्किल रहा है। इस समस्या को हल करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एक एकल-फिलामेंट टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी प्रणाली का वर्णन करता है जो एक ही जैव रासायनिक प्रतिक्रिया में गतिशील एक्टिन और सूक्ष्मनलिका पॉलिमर के प्रत्यक्ष दृश्य को सक्षम बनाता है। इस प्रकार, यह विधि पारंपरिक परखों से परे है जो अकेले एक्टिन फिलामेंट्स या सूक्ष्मनलिकाएं के गतिशील व्यवहार को दोहराती है। इस तकनीक को ताऊ के साथ एक उदाहरण के रूप में भी किया गया था कि साइटोस्केलेटन युग्मन कारक की उपस्थिति में कितने गतिशील गुण बदलते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अतिरिक्त प्रोटीन के साथ किया जा सकता है जिसे एक्टिन या सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का समन्वय करने के लिए जाना जाता है या संदिग्ध किया जा सकता है, जिसमें एमएसीएफ, जीएएस, फॉर्मिन और बहुत कुछ शामिल है (लेकिन सीमित नहीं है)। अंत में, प्रदान किए गए उदाहरण विश्लेषण इस प्रोटोकॉल के साथ अधिग्रहित डेटा को मापने के लिए एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

“देखना विश्वास है” माइक्रोस्कोपी-आधारित परख करने का एक सम्मोहक कारण है। हालांकि, टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के निष्पादन और व्याख्या में सावधानी की आवश्यकता है। साइटोस्केलेटल सह-असेंबली परख की एक बड़ी चुनौती यह है कि कई आमतौर पर उपयोग की जाने वाली इमेजिंग स्थितियां प्रत्येक बहुलक के अनुरूप नहीं हैं। सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन में आमतौर पर पोलीमराइजेशन के लिए अलग-अलग बफर, तापमान, नमक, न्यूक्लियोटाइड और एकाग्रता आवश्यकताएं होती हैं। एक्टिन, ट्यूबुलिन, ब्याज के नियामक प्रोटीन, और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफर फ्रीज-पिघलना चक्रों के प्रति संवेदनशील हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए प्रोटीन और बफर की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग आवश्यक है। इनमें से कई चिंताओं को कम करने के लिए, ताजा पुनर्नवीनीकरण ट्यूबुलिन (<6 सप्ताह के लिए जमे हुए) का उपयोग करना, और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से पूर्व-समाशोधन जमे हुए / ये विचार इस प्रक्रिया के साथ मूल्यांकन किए जाने वाले नियामक प्रोटीन के असंख्य पर भी लागू होते हैं, जो फ्रीज-पिघलना चक्र या बफर लवण 5,11,36 की एकाग्रता के प्रति संवेदनशील हो सकते हैं।

दुर्भाग्य से, प्रयोगात्मक ट्रेडऑफ के बिना कोई भी आकार-फिट-सभी बफर मौजूद नहीं है। कम एकाग्रता के प्रोटीन के लिए अधिक मात्रा उपयुक्त करने के लिए, एटीपी और जीटीपी को 2x टीआईआरएफ बफर समाधान (चित्रा 1 सी) में शामिल किया जा सकता है। हालांकि, क्योंकि ये न्यूक्लियोटाइड फ्रीज-पिघलना चक्रों के प्रति बेहद संवेदनशील हैं, इसलिए इसकी सिफारिश नहीं की जाती है। यहां उपयोग किए जाने वाले ऑक्सीजन मैला ढोने वाले यौगिक (यानी, कैटालेज़ और ग्लूकोज-ऑक्सीडेज) लंबे समय तक प्रोटीन की कल्पना करने के लिए आवश्यक हैं (मिनट से घंटों तक), लेकिन उच्च सांद्रता पर सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन को प्रतिबंधित करने के लिए जाने जाते हैं5. इन बफर विचारों से संबंधित, इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि कुछ विहित सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़े नियामक प्रोटीन को अकेले सूक्ष्मनलिकाएं (एक्टिन के बिना) का उपयोग करके कोशिकाओं या परखों में पाए जाने वाले कार्यों को दोहराने के लिए कम या ज्यादा नमक की आवश्यकता हो सकती है। इन चिंताओं को दूर करने के लिए नमक की प्रकृति या एकाग्रता को बदलने से एक्टिन फिलामेंट पोलीमराइजेशन और / या सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के मापदंडों की दर प्रभावित होगी। प्रोटोकॉल की सफलता की पुष्टि करने या विशिष्ट बफर या नियामक प्रोटीन के प्रभावों को स्पष्ट रूप से दस्तावेज करने के लिए कई वर्णनात्मक मापदंडों (न्यूनतम, न्यूक्लिएशन, बढ़ाव दर, और स्थिरता) (चित्रा 3) के माप की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, बहुत अधिक एक्टिन फिलामेंट पोलीमराइजेशन सेकंड के भीतर एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन घटनाओं को अस्पष्ट कर सकता है। नतीजतन, एक्टिन की समग्र एकाग्रता को कम करके या एक्टिन न्यूक्लिएशन (यानी, प्रोफिलिन) को दबाने के लिए अतिरिक्त प्रोटीन सहित ठीक-ट्यूनिंग प्रयोगात्मक स्थितियां समग्र अवधि का विस्तार करेंगी जो समन्वित एक्टिन-सूक्ष्मनलिका गतिविधियों को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। इन पूर्वापेक्षाओं को संबोधित करने वाले नियंत्रण, और तकनीकी प्रतिकृतियां (देखने के कई क्षेत्रों से परे), उपयोगकर्ताओं के लिए विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

सेल-आधारित अध्ययन प्रत्यक्ष प्रोटीन-प्रोटीन संबंधों या नियामक परिसरों की कार्रवाई का निरीक्षण करने के लिए सीमित अवसर प्रदान करते हैं। इसके विपरीत, इन विट्रो परखों से प्राप्त कुछ तंत्र हमेशा कोशिकाओं में देखे गए प्रोटीन के सटीक व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इस क्लासिक बायोकेमिस्ट दुविधा को विशिष्ट संशोधनों के साथ इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों में संबोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कार्यात्मक फ्लोरोसेंटली लेबल युग्मन प्रोटीन जोड़ना इस विधि को एकल-फिलामेंट अध्ययन से एकल-अणु अध्ययन तक फैलाता है। परख को सेल अर्क का उपयोग करने के लिए और संशोधित किया जा सकता है जो सेल जैसी घटनाओं को दोहराने के लिए आवश्यक “लापता” अज्ञात कुंजी कारकों को जोड़ सकता है। उदाहरण के लिए, खमीर या ज़ेनोपस अर्क को नियोजित करने वाले टीआईआरएफ-आधारित परखों ने सिकुड़ा हुआ एक्टोमायोसिन के छल्ले37, माइटोटिक स्पिंडल 26,38, एक्टिन या सूक्ष्मनलिका असेंबलीके घटकों 39,40, और यहां तक कि सेंट्रोसोम और कीनेटोकोर्स 36,41,42,43 पर गतिशीलता का पुनर्गठन किया है . इसके अलावा, ऐसी प्रणालियां कृत्रिम सेल प्रणालियों की ओर मार्ग प्रशस्त कर सकती हैं जिनमें लिपिड या सिग्नलिंग कारक44,45,46 मौजूद हैं।

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

मैं इस प्रोटोकॉल पर उपयोगी टिप्पणियों के लिए मार्क रिडिला (मरम्मत बायोटेक्नोलॉजीज) और ब्रायन हारर (सनी अपस्टेट) का आभारी हूं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (जीएम 133485) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

1% BSA (w/v) Fisher Scientific BP1600-100 For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter.
1× BRB80 Homemade 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO G2133-50KU Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use
100 µM tubulin Cytoskeleton Inc, Denver, CO T240 Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
100 mM ATP Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO A-081 Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.
100 mM GTP Fisher Scientific AC226250010 Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.
120-150 mW solid-state lasers Leica Microsystems 11889151; 11889148
2 mg/mL catalase Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO C40-100 Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use
2× TIRF buffer Homemade 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.
24 × 60 mm, #1.5 coverglass Fisher Scientific, Waltham, MA 22-266882 Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)
37 oC heatblock
37 oC water bath
5 mg/mL Streptavidin (600x stock) Avantor, Philadelphia, PA RLS000-01 Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use
5 min Epoxy resin and hardener Loctite, Rocky Hill, CT 1365736 Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.
50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds Cytoskeleton Inc; Homemade T333P (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).
70 oC incubator
Actin mix stock Homemade; this protocol A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).
Appropriate buffer controls Homemade Combination of buffers from all proteins being assessed
Biotin-PEG-silane (MW 3,400) Laysan Bio Inc biotin-PEG-SIL-3400 Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Biotinylated actin Cytoskeleton Inc; Homemade AB07 Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.  Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.
Dishsoap Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.
Dry ice
FIJI Software www.https://imagej.net/software/fiji/downloads Schneider et al. (2012)31.
Fluorescently labeled actin Cytoskeleton Inc; Homemade AR05 Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use.
Fluorescently labeled tubulin Cytoskeleton Inc TL488M, TLA590M, TL670M Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
G-buffer Homemade 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP
HEK Buffer Homemade 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl
Ice
Ice bucket
Imaging chambers IBIDI, Fitchburg, WI 80666 Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings
iXon Life 897 EMCCD camera Andor, Belfast, Northern Ireland 8114137
LASX Premium microscope software Leica Microsystems 11640611
Methylcellulose (4,000 cp) Sigma Aldrich Inc M0512
Microscope base equipped with TIRF module Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11889146
mPEG-silane (MW 2,000) Laysan Bio Inc, Arab, AL mPEG-SIL-2000 Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Objective heater and heated stage insert OKO labs, Pozzioli, Italy 8113569 Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.
Perfusion pump Harvard Apparatus, Holliston, MA 704504 A syringe and tubing can be substituted.
Petri Dish, 100 x 15 mm Genesee Scientific, San Diego, CA 32-107
Plastic slide mailer container Fisher Scientific HS15986
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick Grace Biolabs, Bend, OR 620001 Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.
Small styrofoam container Abcam, Cambridge, UK Reused from shipping
Small weigh boat Fisher Scientific 02-202-100
Spectrophotometer
Tau Cytoskeleton Inc TA01 Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20).
Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective Leica Microsystems 11506319
Tubulin stock Homemade; this protocol A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.
Unlabeled actin (dark) Cytoskeleton Inc; Homemade AKL99 Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended).
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References

  1. Pimm, M. L., Henty-Ridilla, J. L. New twists in actin-microtubule interactions. Molecular Biology of the Cell. 32 (3), 211-217 (2021).
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Henty-Ridilla, J. L. Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e64074, doi:10.3791/64074 (2022).
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