हेमटोपोइएटिक साइटोकिन के साथ ट्यूमर टीकाकरण का उपयोग करके प्रयोगात्मक मेलेनोमा इम्यूनोथेरेपी मॉडल
Summary
प्रोटोकॉल एफएलटी 3 एल-व्यक्त बी 16-एफ 10 मेलेनोमा के साथ सेल-आधारित ट्यूमर टीकाकरण का उपयोग करके एक कैंसर इम्यूनोथेरेपी मॉडल प्रस्तुत करता है। यह प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करता है, जिसमें सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी, ट्यूमर प्रत्यारोपण, सेल विकिरण, ट्यूमर के विकास का माप, इंट्राट्यूमरल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अलगाव और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण शामिल हैं।
Abstract
एफएमएस जैसे टायरोसिन किनेज 3 लिगैंड (एफएलटी 3 एल) एक हेमटोपोइएटिक साइटोकिन है जो डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) के अस्तित्व और भेदभाव को बढ़ावा देता है। इसका उपयोग ट्यूमर टीकों में जन्मजात प्रतिरक्षा को सक्रिय करने और एंटीट्यूमर प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने के लिए किया गया है। यह प्रोटोकॉल सेल-आधारित ट्यूमर वैक्सीन का उपयोग करके एक चिकित्सीय मॉडल प्रदर्शित करता है जिसमें ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के फेनोटाइपिक और कार्यात्मक विश्लेषण के साथ एफएलटी 3 एल-व्यक्त बी 16-एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाएं शामिल हैं। सुसंस्कृत ट्यूमर सेल तैयारी, ट्यूमर आरोपण, सेल विकिरण, ट्यूमर आकार माप, इंट्राट्यूमरल प्रतिरक्षा कोशिका अलगाव और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य एक प्रीक्लिनिकल ठोस ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी मॉडल प्रदान करना है, और ट्यूमर कोशिकाओं और घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक शोध मंच है। यहां वर्णित इम्यूनोथेरेपी प्रोटोकॉल को अन्य चिकित्सीय तौर-तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे कि प्रतिरक्षा चेकपॉइंट नाकाबंदी (एंटी-सीटीएलए -4, एंटी-पीडी -1, एंटी-पीडी-एल 1 एंटीबॉडी) या मेलेनोमा के कैंसर चिकित्सीय प्रभाव में सुधार के लिए कीमोथेरेपी।
Introduction
कैंसर इम्यूनोथेरेपी को इसके कम विषाक्त दुष्प्रभावों और अधिक टिकाऊ प्रतिक्रियाओं के आधार पर एक आशाजनक चिकित्सीय रणनीति के रूप में मान्यता दी गई है। कई प्रकार के इम्यूनोथेरेपी विकसित किए गए हैं, जिनमें ऑनकोलिटिक वायरस थेरेपी, कैंसर टीके, साइटोकिन थेरेपी, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, दत्तक सेल ट्रांसफर (सीएआर-टी कोशिकाएं या सीएआर-एनके), और प्रतिरक्षा चेकपॉइंट नाकाबंदी1 शामिल हैं।
कैंसर के टीकों के लिए, चिकित्सीय टीकों के विभिन्न रूप हैं, जैसे कि पूरे सेल-आधारित टीके, प्रोटीन या पेप्टाइड टीके, और आरएनए या डीएनए टीके। टीकाकरण ट्यूमर-विशिष्ट एंटीजन सहित ट्यूमर एंटीजन को संसाधित करने के लिए एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (एपीआई) की क्षमता पर निर्भर करता है, और उन्हें टी कोशिकाओं को एक इम्युनोजेनिक रूप में प्रस्तुत करता है। डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) को सबसे शक्तिशाली एपीआई के रूप में जाना जाता है और माना जाता है कि एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा 2,3 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ये कोशिकाएं ट्यूमर एंटीजन को लेती हैं और संसाधित करती हैं, और फिर टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) और कोस्टिमुलेटरी अणुओं की सगाई के माध्यम से ट्यूमर-विशिष्ट टी प्रभावक (टेफ) कोशिकाओं को प्राइम और सक्रिय करने के लिए ड्रेनिंग लिम्फ नोड्स (डीएलएन) में स्थानांतरित होती हैं। इसके परिणामस्वरूप ट्यूमर-विशिष्ट साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं (सीटीएल) का भेदभाव और विस्तार होता है, जो ट्यूमर में घुसपैठ करते हैं और ट्यूमर कोशिकाओं को मारतेहैं। नतीजतन, डीसी की सक्रियता और परिपक्वता ट्यूमर एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षा को प्रोत्साहित करने के लिए आकर्षक रणनीतियों का प्रतिनिधित्व करती है।
Flt3L कार्यात्मक रूप से परिपक्व DCs की परिपक्वता और विस्तार को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है जो MHC वर्ग II, CD11c, DEC205 और CD86 प्रोटीन5 को व्यक्त करते हैं। इंट्राट्यूमरल, लेकिन अंतःशिरा नहीं, एफएलटी 3 एल जीन (एडीवी-एफएलटी 3 एल ) को शामिल करने वाले एडेनोवायरस वेक्टर के प्रशासन को ऑर्थ्रोटोपिक ट्यूमर6 के खिलाफ प्रतिरक्षा चिकित्सीय गतिविधि को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। एफएलटी 3 एल का उपयोग ट्यूमर सेल-आधारित टीकों में भी किया गया है जिसमें विकिरणित बी 16-एफ 10 कोशिकाएं शामिल हैं जो डीसी द्वारा ट्यूमर एंटीजन की क्रॉस-प्रस्तुति को बढ़ाने के तरीके के रूप में रेट्रोवायरल ट्रांसड्यूस्ड एफएलटी 3 एल को स्थिर रूप से व्यक्त करती हैं और इस प्रकार, एंटीट्यूमर प्रतिक्रियाओं को बढ़ाती हैं। यहां वर्णित बी 16-एफएलटी 3 एल ट्यूमर टीकाकरण का प्रोटोकॉल डॉ जेम्स एलिसन के समूह7 द्वारा प्रकाशित एक अध्ययन पर आधारित है। इस पेपर में, उन्होंने बताया कि सीटीएलए -4 नाकाबंदी के साथ संयुक्त बी 16-एफएलटी 3 एल वैक्सीन ने सहक्रियात्मक रूप से स्थापित मेलेनोमा की अस्वीकृति को प्रेरित किया, जिसके परिणामस्वरूप जीवित रहने में वृद्धि हुई।
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मेलेनोमा के लिए प्रीक्लिनिकल इम्यूनोथेरेपी मॉडल प्रदान करना है। यहां, ट्यूमर के टीके तैयार करने और प्रत्यारोपित करने के तरीके की विस्तृत प्रक्रियाएं, और ठोस ट्यूमर से इंट्राट्यूमरल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संरचना और कार्य का विश्लेषण कैसे करें, इसका वर्णन किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एलिसन के समूह द्वारा अध्ययन पर आधारित है। उन्होंने दिखाया कि सीटीएलए -4 नाकाबंदी के साथ बी 16-एफएलटी 3 एल वैक्सीन के संयोजन ने जीवित रहने की दर और ट्यूमर के विकास पर एक सहक्रियात्मक ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उत्कृष्ट समर्थन के लिए बी 16-एफएलटी 3 एल कोशिकाओं और एलजेआई पशु और प्रवाह साइटोमेट्री सुविधाओं के कर्मचारियों को प्रदान करने के लिए डॉ स्टीफन स्कोनबर्गर को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
| 30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
| B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
| GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| Antibodies | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
References
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