Transplantation cardiaque cervicale hétérotopique de souris utilisant des brassards vasculaires

Summary

Les modèles de transplantation cardiaque de souris représentent des outils de recherche précieux pour étudier l’immunologie de la transplantation. Le présent protocole détaille la transplantation cardiaque cervicale hétérotopique chez la souris qui implique la mise en place de brassards sur l’artère carotide commune du receveur et le tronc de l’artère pulmonaire du donneur pour permettre le flux sanguin laminaire.

Abstract

Les modèles murins de transplantation cardiaque sont fréquemment utilisés pour étudier les lésions d’ischémie-reperfusion, les réponses immunitaires innées et adaptatives après la transplantation, et l’impact des thérapies immunomodulatrices sur le rejet du greffon. La transplantation cardiaque cervicale hétérotopique chez la souris a été décrite pour la première fois en 1991 à l’aide d’anastomoses suturées, puis modifiée pour inclure des techniques de brassard. Cette modification a permis d’améliorer les taux de réussite et, depuis lors, de nombreux rapports ont proposé d’autres améliorations techniques. Cependant, la traduction en utilisation plus répandue reste limitée en raison de la difficulté technique associée aux anastomoses du greffon, qui nécessite une précision pour atteindre une longueur et un calibre adéquats des brassards afin d’éviter une torsion anastomotique vasculaire ou une tension excessive, ce qui peut endommager le greffon. Le présent protocole décrit une technique modifiée pour effectuer une transplantation cardiaque cervicale hétérotopique chez la souris qui implique la mise en place du brassard sur l’artère carotide commune du receveur et l’artère pulmonaire du donneur en alignement avec la direction du flux sanguin.

Introduction

Abbott et al. ont publié¹ la première description de la transplantation cardiaque abdominale hétérotopique chez le rat en 1964. Ces techniques chirurgicales ont été affinées et simplifiées par Ono et al. en 1969². Corry et al. ont décrit pour la première fois une méthode de transplantation cardiaque abdominale hétérotopique chez la souris en 1973; Semblable aux modèles de rats précédemment rapportés, cela impliquait une greffe dans l’abdomen de l’hôte avec revascularisation par anastomoses de bout en bout de l’artère pulmonaire du donneur et de l’aorte ascendante à la veine cave inférieure et à l’aorte abdominale du receveur, respectivement³. La transplantation cardiaque cervicale hétérotopique chez le rat a été décrite par Heron en 1971 à l’aide de brassards en téflon fabriqués à partir de cathéters intraveineux de 16 G (1,6 mm de diamètre extérieur)⁴. Chen⁵ et Matsuura et ^al.6 ont rapporté plus tard une transplantation cardiaque cervicale hétérotopique chez la souris en 1991, dont les techniques différaient principalement par leur méthode de réanastomose. L’approche de Chen impliquait des anastomoses suturées de l’aorte ascendante du donneur à l’artère carotide du receveur et de l’artère pulmonaire du donneur à la veine jugulaire externe du receveur⁵. En raison des compétences techniques avancées requises pour ces anastomoses suturées microchirurgicales, une quantité importante de temps et d’expérience a été nécessaire pour atteindre un taux de réussite élevé. Matsuura et al. ont décrit une méthode utilisant une technique de brassard sans suture, similaire à celle utilisée par Heron, qui impliquait des anastomoses de bout en bout utilisant le placement extra-luminal des poignets. Il a fabriqué des brassards en téflon à partir de cathéters intraveineux de 22 G (0,8 mm de diamètre extérieur) et 24 G (0,67 mm de diamètre extérieur) et les a placés sur la veine jugulaire externe et l’artère carotide commune du receveur, respectivement⁶. Ces brassards ont ensuite été placés à l’intérieur de l’artère pulmonaire et de l’aorte du donneur et fixés en attachant une ligature de suture autour de la connexion. Cette approche s’est traduite par une amélioration du taux de réussite. Plus important encore, il en a résulté un raccourcissement du temps nécessaire pour compléter les deux anastomoses cervicales, réduisant ainsi le temps ischémique chaud de la greffe à moins d’un tiers de celui utilisé par la méthode de suture abdominale. De plus, comme les brassards sont placés autour de la surface externe du vaisseau, il n’y a pas de corps étranger exposé à la lumière du vaisseau, ce qui réduit considérablement la possibilité de thrombose après la chirurgie⁷. Pendant ce temps, l’utilisation de la technique du brassard fournit un soutien autour des vaisseaux sur le site de l’anastomose sans nécessiter de suture, ce qui réduit le risque de saignement après revascularisation⁶.

De nombreuses révisions de cette technique ont été proposées. Pour tenir compte de la courte longueur de l’artère carotide commune de la souris (environ 5 mm), Tomita et ^al.8 ont développé une modification de cette technique avec un brassard artériel plus petit (0,6 mm de diamètre extérieur) tout en omettant de tenir les sutures et de tirer l’artère directement à travers le brassard avec une pince fine. Wang et coll. ont simplifié cette approche en plaçant des brassards de 22 G et 24 G sur l’artère pulmonaire droite du donneur et sur l’artère carotide commune droite du receveur, respectivement⁹. Divers rapports ont décrit des modifications à ces approches, y compris l’utilisation de brassards spécialisés, de pinces microchirurgicales, de dilatateurs de vaisseaux et de cardioplégie^10,11,12. Notamment, toutes ces méthodes impliquent la circulation rétrograde du sang à travers le cœur, le sang circulant de l’artère carotide commune du receveur vers l’aorte du donneur, les artères coronaires, le sinus coronaire, puis se vidant dans l’oreillette droite et sortant de l’artère pulmonaire dans la veine jugulaire externe du receveur.

Par rapport à la greffe dans l’abdomen, la transplantation cardiaque cervicale offre de multiples avantages. Comme mentionné précédemment, l’exposition cervicale permet une revascularisation plus rapide et des temps ischémiques chauds plus courts⁶. La méthode cervicale est également moins invasive et est associée à des temps de récupération postopératoire plus courts car elle évite une laparotomie⁶. Il est important de noter que des anastomoses de bout en bout avec des brassards peuvent être effectuées à la place des anastomoses de bout en bout, ce qui diminue le risque de complications telles que les saignements anastomotiques. L’approche abdominale présente également un risque accru de développer des complications thrombotiques dans l’aorte abdominale ou la veine cave inférieure, entraînant une ischémie de la moelle épinière et une paralysie des membres postérieurs. L’emplacement cervical superficiel de la greffe permet un accès facile à l’évaluation de la viabilité du greffon par palpation, électrocardiographie et imagerie invasive ou non invasive. Bien que les greffes cervicales reprennent une activité cardiaque spontanée après reperfusion, elles n’ont pas d’impact significatif sur les paramètres systoliques et diastoliques de la receveuse. Ce modèle fournit des informations précieuses pour étudier les réponses cellulaires après une transplantation, telles que les lésions d’ischémie-reperfusion et le rejet de greffe. De plus, ce modèle offre une approche idéale pour permettre l’imagerie post-transplantation, comme la microscopie intravitale à deux photons ou l’imagerie par tomographie par émission de positrons (TEP). À cette fin, notre laboratoire a déjà mis au point des méthodes pour imager les tissus et les organes en mouvement chez la souris, y compris des cœurs murins battants et des greffes d’arc aortique après une transplantation cervicale hétérotopique pour visualiser le trafic des leucocytes au cours d’une lésion d’ischémie-reperfusion et dans des plaques d’athérosclérose, respectivement^13,14,15 . De plus, en raison de son emplacement superficiel et de sa facilité d’exposition, ce modèle convient à la retransplantation cardiaque¹⁶.

Ce rapport décrit une technique qui permet un flux sanguin laminaire avec le placement externe des brassards vasculaires sur les vaisseaux d’où provient le flux sanguin. Cela permet une transition en douceur du flux sanguin d’un vaisseau à l’autre, évitant ainsi l’exposition du bord distal du vaisseau dans la lumière vasculaire. De plus, la technique utilise un brassard plus grand de 20 G, au lieu des brassards de 22 G utilisés auparavant, pour l’artère pulmonaire du donneur afin d’assurer un retour suffisant du flux sanguin vers le receveur.

Protocol

Toutes les procédures de manipulation des animaux ont été menées conformément aux directives des NIH sur les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par le Comité des études animales de la faculté de médecine de l’Université de Washington. Des cœurs de souris C57BL/6 (B6) et BALB/c (pesant 20 à 25 g) ont été transplantés chez des receveurs B6 appariés (âgés de 6 à 8 semaines). Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux</str…

Representative Results

Ce modèle de transplantation cardiaque hétérotopique cervicale de souris a été utilisé pour effectuer plus de 1 000 greffes dans notre laboratoire, avec un taux de survie d’environ 97%. Le taux de réussite est légèrement supérieur à celui des rapports précédents utilisant d’autres techniques de transplantation cardiaque hétérotopique cervicale chez la souris10,11,20. Cela pourrait être attribué au brassard p…

Discussion

En utilisant cette technique, la transplantation cardiaque cervicale hétérotopique de souris peut être réalisée en moins de 40 minutes par un microchirurgien expérimenté et en environ 60 minutes par un microchirurgien débutant. Alors que la transplantation cardiaque cervicale a été étudiée dans de nombreux modèles animaux, un modèle murin reste l’étalon-or en raison de multiples souches génétiques bien définies, des capacités d’altération génétique et de la disponibilité de nombreux réactifs, …

Materials

6-0 braided silk ties	Henry Schein Inc	7718729
0.75% Providone iosine scrub	Priority Care Inc	NDC 57319-327-0
10-0 nylon suture	Surgical Specialties Corporation	AK-0106
655-nm nontargeted Q-dots	Invitrogen	Q21021MP
70% Ethanol	Pharmco Products Inc	111000140
8-0 braided silk ties	Henry Schein Inc	1005597
Adson forceps	Fine Science Tools Inc	91127-12
BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks)	Jackson Laboratories
Bipolar coagulator	Valleylab Inc	SurgII-20, E6008/E6008B
Carprofen (Rimadyl) injection	Transpharm	35844
Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet	Transpharm	38995/37919
Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software	A&B Software
Dumont no. 5 forceps	Fine Science Tools Inc	11251-20
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc	15000-03
GraphPad Prism 5.0	Sun Microsystems Inc.
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc	91201-13
Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc	91309-12
Harvard Apparatus mouse ventilator model 687	Harvard Apparatus	MA1 55-0001
Heparin solution (100 U/mL)	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Imaris	Bitplane
Ketamine (50 mg/kg)	Wyeth	206205-01
Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification	Leica Microsystems
Moria extra fine spring scissors	Fine Science Tools Inc	15396-00
Ohio isoflurane vaporizer	Parkland Scientific	V3000i
Qdots	ThermoFisher	1604036
S&T SuperGrip Forceps angled tip	Fine Science Tools Inc	00649-11
S&T SuperGrip Forceps straight tip	Fine Science Tools Inc	00632-11
Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride	Hospira Inc	NDC 0409-4888-20
Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators)	Puritan Medical Company LLC	823-WC
Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter	Terumo Medical Corporation	SR-OX2032CA
Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter	Terumo Medical Corporation	R-OX2419CA
ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity)	Thermocare Inc
VetBond	Santa Cruz Biotechnology SC361931	NC0846393
Xylazine (10 mg/kg)	Lloyd Laboratories	139-236