무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.
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방법 논문
생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
대부분의 세포는 근본적인 세포 과정을 수행하기 위해 모양을 감지하고 변경할 수 있습니다. 많은 진핵생물에서, 셉틴 세포골격은 사이토카인증, 편광된 성장 및 이동과 같은 형태 변화를 조정하는데 필수적인 성분이다. 셉틴은 다양한 고차 구조를 형성하기 위해 조립하는 필라멘트 형성 단백질이며, 많은 경우 원형질막의 다른 영역, 특히 미크론 규모의 양성 곡률 영역에서 발견됩니다. 생체 내에서 셉틴 조립 과정을 모니터링하는 것은 세포의 광 현미경 검사의 한계뿐만 아니라 막 및 세포 골격 요소와의 상호 작용의 복잡성으로 인해 방해를 받아 살아있는 시스템에서 셉틴 역학을 정량화하기가 어렵습니다. 다행스럽게도, 지난 십 년 동안 높은 공간 및 시간적 해상도에서 셉틴 어셈블리를 제어하는 메커니즘을 해부하기 위해 세포없는 시스템에서 셉틴 세포 골격을 재구성하는 데 상당한 진전이있었습니다. 셉틴 조립의 핵심 단계는 셉틴 헤테로올리고머 회합 및 막과의 해리, 필라멘트로의 중합, 필라멘트 간의 상호작용을 통한 고차 구조의 형성을 포함한다. 여기에서는 다른 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 방법을 제시합니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대. 이러한 방법은 조립의 여러 단계에서 셉틴의 생물 물리학 적 매개 변수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다 : 멤브레인을 결합하는 단일 옥타머로서, 필라멘트로서, 필라멘트의 어셈블리로. 우리는 곡률 샘플링 및 우대 흡착의 측정과 함께 이러한 매개 변수를 사용하여 곡률 감지가 다양한 길이 및 시간 척도에서 어떻게 작동하는지 이해합니다.
서론
세포의 모양과 많은 내부 구획은 그들을 둘러싸고있는 지질 막에 의존합니다. 막은 단백질과의 상호작용, 지질 분류 및 내외부 힘의 작용을 통해 변형되어 다양한 형상 1,2,3,4을 생성할 수 있는 점탄성 구조이다. 이러한 형상은 종종 막 곡률의 관점에서 설명된다. 세포는 세포 밀매, 사이토카인증 및 이동5,6을 포함하는 과정에 대해 정의된 시공간적 제어를 보장하기 위해, 특정 막 곡률에 우선적으로 조립하거나 "감지"할 수 있는 다양한 단백질 세트를 사용한다. 멤브레인에서 세포 기계의 역학은 시간과 공간 분해능과 세포 건강의 균형을 맞추는 것이 어렵 기 때문에 관찰하기가 특히 어렵습니다. 초분해능 기술은 이러한 구조에 대한 자세한 보기를 제공할 수 있지만, 대부분의 기계류에서 조립/분해의 시간 척도에 부합하지 않는 긴 인수가 필요합니다. 또한, 이러한 어셈블리의 기본 환경에서 분자 복잡성과 단일 구성 요소가 수행 할 수있는 다양한 역할은 최소한의 재구성 시스템을....
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프로토콜
참고: 지지된 지질 이중층을 형성하려면 단분산 된 소형 일조기 소포 (SUV)를 준비해야합니다. SUV 형성에 대해 이전에 발표 된 프로토콜24를 참조하십시오. 간단히 말해서, 모든 SUV는 4 분 초음파 처리 기간을 통해 70 % 진폭에서 총 12 분 동안 프로브 초음파 처리에 의해 형성되고 얼음물에서 2 분의 휴식 기간이 뒤 따른다. SUV 솔루션은 크기가 잘 명확하고 단분산되어야합니다. SUV의 크기 분포는 예를 들어, 동적 광산란(25)에 의해 측정될 수 있다.
1. 평면 지질 이중층
- 슬라이드의 플라즈마 청소
참고: 플라즈마 세척은 유기 오염 물질을 제거하고 유리의 친수성을 증가시켜 효율적인 지질 흡착을 보장합니다. 다음 단계는 사용되는 플라즈마 클리너 및 유리 커버슬립에 따라 변경되거나 최적화될 필요가 있습니다.- 플라즈마 클리너를 산소로 5 분 동안 정화하여 라인과 챔버에서 공기를 제거하십시오. 이는 플라즈마 클리너가 실행될 때 라인과 챔버에 주로 산소가 존재하여보다 일관된 이중층 준비를 제공하도록하기위한 것입니다.
- 퍼징하는 동안N2 또는 Ar....
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결과
각각의 SLB의 제조에 이어서, 셉틴 또는 관심있는 단백질은 원하는 지지체와 함께 인큐베이션되고 TIRFM, 공초점 현미경 또는 SEM을 통해 영상화될 수 있다. 여기에 나타낸 결과는 대장균17로부터 재조합적으로 발현되고 정제된 셉틴을 사용한다. 평면 SLB에서 TIRFM을 사용하면 필라멘트의 길이와 유연성을 결정하고 확산 계수를 측정하며 시간28,29에 따른 조립을 관찰 할 수 있습니다. 최고 품질의 측정을 수집하기 위해서는 먼저 이중층의 품질을 확인해야하며, 특히 처음으로 준비하거나 지질 조성을 변경할 때 특히 그렇습니다. TIRFM에 의한 이중층에서의 단백질 분포를 육안으로 검사하면 긁혔거나 기형화된 이중층의 영역을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 단백질 분포는 균질해야 하며(그림 3A), 이중층에 구멍.......
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토론
세포막은 다양한 모양, 곡률 및 물리 화학적 특성을 취합니다. 세포가 마이크로미터 규모의 어셈블리를 구축하는 나노미터 규모의 기계를 연구하기 위해서는 멤브레인 모방체의 최소 재구성 시스템을 설계할 필요가 있다. 이 프로토콜은 막 곡률과 조성을 정밀하게 제어하면서 사용자가 널리 이용 가능한 현미경 기술을 사용하여 정량적 형광 측정을 쉽게 수행 할 수있게 해주는 기술을 제시합니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 구성 요소는 적절한 표면에 우물을 조립하고 지질을 처리하는 것입니다. 여기에 설명 된 웰은 PCR 튜브 및 UV 활성화 접착제를 사용하여 수작업으로 제작되었습니다. 조립 중에 반응 영역 내부에 접착제가 생기지 않는 것이 중요합니다. 이것은 우물의 가장자리를 따라 이미징하고 커버 글라스 상에 고단백질 흡착을 찾음으로써 실험 중에 확인할 수 있습니다. 사용자는 상업적으로 주문할 수 있는 실리콘과 같은 웰에 대체 재료를 사용하도록 선택할 수 있지만, 제시된 방법은 이동하거나 누출되지 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립 보건원 (NIH) 그랜트 No의 지원을 받았다. R01 GM-130934 및 NSF (National Science Foundation) 그랜트 MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V., K.S.C.는 T32 GM119999 어워드에 따라 국립 일반 의료 과학 연구소의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 플랫 캡이 있는 0.2mL PCR 튜브, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5mL 저접착 튜브 | USA Scientific | 1405-2600 | |
| 베타 메르캅토에탄올(BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| PEGylated coverslips Thermo 제작용 커버 글라스 | Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE 커버 글라스 24x50 #1.5 |
| DOPC | Avanti 극성 지질 | 850375 | |
| 계란 리스 로다민 PE | Avanti 극성 지질 | 810146 | |
| EMS 글루타르알데히드 수성 25%, EM 등급 | VWR | 16220 | |
| EMS 카코딜레이트 나트륨 버퍼 | VWR | 11652 | |
| 에탄올, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| 헥사메틸디실라잔 | 시그마-알드리치 | 440191 | |
| 염화마그네슘 | VWR | 7791-18-6 | |
| 메틸 셀룰로오스 4000cp | 시그마-알드리치 | M052-100G | |
| 평면 이중층용 마이크로글라스 커버슬립 | Matsunami | 단종된 | 22x22 |
| 미니 원심분리기 | |||
| 비기능성 실리카 마이크로스피어 | Bangs Laboratories, Inc. | 크기에 따라 다름 : SS0200 * -SS0500 * | 수성 현탁액의 실리카 |
| 광학 접착제 | Norland Thorlabs | NOA 68 | 유리 또는 플라스틱 용 유연한 접착제 |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| 플라즈마 클리너 | 플라즈마 에칭 | PE-25 | 전압 : 120V, 60Hz. 전류 : 15 AMPS |
| 염화칼 | VWR | 0395-1kg | |
| 원형 커버글라스, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator 욕조 | Branson | 1510R-MT | Bransonic 초음파 세척기. 50-60 Hz. 출력: 70W |
| 대두 PI | Avanti 극성 지질 | 840044 | |
| 탁상용 원심분리기 | Eppendorf | 22331 | |
| UV 램프 | Spectroline | ENF-260C | 115 볼트, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass 마이크로파이버 여과지 | VWR | 28455-030 | 직경 42.5mm, 등급 GF/C |
참고문헌
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33....
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재인쇄 및 허가
