Caenorhabditis elegans fungerer som et utmerket modellsystem med robuste og rimelige metoder for å kartlegge helsespan, levetid og motstandskraft mot stress.
Oppdagelsen og utviklingen av Caenorhabditis elegans som modellorganisme var innflytelsesrik i biologi, spesielt innen aldring. Mange historiske og moderne studier har identifisert tusenvis av levetidsendrende paradigmer, inkludert genetiske mutasjoner, transgent genuttrykk og hormesis, en gunstig, lavverdig eksponering for stress. Med sine mange fordeler, inkludert kort levetid, enkelt og rimelig vedlikehold, og fullt sekvensert genom med homologi til nesten to tredjedeler av alle menneskelige gener, har C. elegans raskt blitt vedtatt som en fremragende modell for stress og aldringsbiologi. Her kartlegges flere standardiserte metoder for å måle levetid og helse som enkelt kan tilpasses nesten alle forskningsmiljøer, spesielt de med begrenset utstyr og midler. Den utrolige nytten av C. elegans er omtalt, og fremhever kapasiteten til å utføre kraftige genetiske analyser i aldrende biologi uten behov for omfattende infrastruktur. Til slutt diskuteres begrensningene i hver analyse og alternative tilnærminger for vurdering.
Siden tidspunktet for utgivelsen av ‘The genetics of Caenorhabditis elegans‘, en av de mest innflytelsesrike artiklene av Sydney Brenner i 1974, har denne mikroskopiske ormen blitt ansett som et fremragende modellsystem for å studere biologiske mysterier1. I 1977 publiserte Michael R. Klass metoden for å måle levetiden til C. elegans og etablerte dette modellsystemet for å studere aldring2. Undersøkelsen for å forstå forholdet mellom stress og lang levetid har startet med identifisering av en enkelt mutasjon i alder-1-genet, noe som resulterte i en levetidsforlengelse i C. elegans3. Videre har moderne studier identifisert andre levetidsøkende mutasjoner, som avslørte langlivede mutante ormer som utviser økt motstand mot stress 4,5,6. Med sine mange fordeler, inkludert kort levetid, enkelt vedlikehold, fullstendig sekvensert genom som inneholder homologi til omtrent to tredjedeler av alle menneskelige sykdomsfremkallende gener, tilgjengelighet og enkel bruk av RNA-interferens (RNAi) biblioteker og fysiologisk likhet med mennesker 7,8,9, har C. elegans raskt blitt vedtatt som en fremragende modell for stress og aldringsbiologi.
Kanskje de største verktøyene til C. elegans er dens ekstremt lave vedlikeholdskostnader, enkel eksperimentering og mangfoldet av genetiske verktøy som er tilgjengelige for studier. C. elegans dyrkes vanligvis på et solid agarmedium med en E. coli matkilde. To vanlige E. coli-stammer er standard OP50, en B-stamme som kanskje er den mest brukte10, og HT115, en K-12-stamme som primært brukes til RNAi-eksperimenter11,12. HT115 K-12-stammen bærer en delesjon i RNAIII RNase, en mutasjon som er avgjørende for RNAi-metoder, hvor plasmider som uttrykker dsRNA som tilsvarer individuelle C. elegans-gener, brukes. DsRNA-fôringsvektorene tillater robust knockdown av C. elegans-gener uten behov for komplekse kryss eller genomredigering, da bakterier som bærer disse plasmidene kan mates direkte til nematoder. Tusenvis av disse bakterielle RNAi-vektorene finnes i HT115-bakgrunnen, inkludert det mest populære Vidal RNAi-biblioteket med >19 000 individuelle RNAi-konstruksjoner13 og Ahringer RNAi-biblioteket med 16 757 RNAi-konstruksjoner14. Imidlertid har OP50 og HT115 bakterielle dietter store forskjeller i metabolsk profil, inkludert forskjeller i vitamin B1215,16. Derfor anbefales det å utføre alle eksperimenter på en enkelt bakteriekilde, om mulig, for å unngå gen-diett-interaksjoner som kan introdusere flere forstyrrende faktorer som tidligere beskrevet 17,18,19. På grunn av sin letthet opprettholdes dyr på OP50 for alle eksperimentelle forhold beskrevet her, men alle eksperimenter utføres på HT115 som tidligere beskrevet20. Kort fortalt opprettholdes dyr ved OP50 og overføres til HT115 etter synkronisering (etter bleking) for konsistens mellom RNAi vs. ikke-RNAi eksperimenter. Alternativt kan en RNAi-kompetent OP50-stamme som bærer en lignende sletting av RNAIII RNase funnet i E. coli K12 HT115-stammen også brukes21.
Kanskje en stor begrensning for RNAi eksperimenter i C. elegans er bekymringen for knockdown effektivitet. Mens knockdown effektivitet kan valideres via qPCR eller western blotting, krever disse dyrt utstyr og reagenser og er begrenset til bulkanalyse. Dette er enda mer av en bekymring å se på bestemte celler, for eksempel nevroner, som er ildfaste (mindre følsomme) for RNAi. Mens RNAi-effektiviteten i spesifikke celler kan forbedres via overekspresjon av SID-1, transmembranproteinet som er essensielt for dsRNA-opptak22, er dette fortsatt begrenset til de celletypespesifikke uttrykksmønstrene til promotorene som brukes til disse konstruksjonene, og dermed er gen knockouts og mutasjoner det mest idiotsikre middelet for å tømme genfunksjoner. Utover RNAi-mediert knockdown er C. elegans også svært mottagelige for genomredigering med CRISPR-baserte strategier 23,24,25 og transgen konstruksjonsoveruttrykk gjennom mikroinjeksjoner, med mulighet for å integrere transgene konstruksjoner gjennom bestråling eller transposonbasert integrasjon 26,27,28,29 . Imidlertid krever disse metodene dyrt mikroinjeksjonsutstyr, og de høye kostnadene ved guide RNA eller Cas9 enzym kan forby disse metodene i institusjoner med begrenset finansiering. I stedet er tusenvis av transgene linjer og mutanter lett tilgjengelige for noen få dollar både på Caenorhabditis Genetics Center (CGC) og National Bioresource Project (NBRP). NBRP tilbyr isolerte mutanter for et stort antall C. elegans gener, inkludert publiserte og derfor verifiserte mutantstammer, mutanter avledet fra pilotprosjekter og mutanter som ennå ikke er karakterisert. I motsetning til dette er CGC et depot av for det meste publiserte og etablerte C. elegans linjer fra forskningsmiljøet. Begge sender stammer over hele verden til svært rimelige priser og tilbyr et bredt utvalg av alternativer for de med begrenset kapasitet til å syntetisere stammer internt.
Her tilbys en kuratert metodesamling, som sannsynligvis vil være de laveste kostnadsmetodene for å analysere levetid og helsespan i C. elegans. Alle metodene som presenteres her krever billig utstyr og forsyninger, og bruker bare stammer som er lett tilgjengelige fra CGC. Kanskje mest uoverkommelig for levetid og overlevelsesanalyser i C. elegans er kostnaden for Nematode Growth Media (NGM) plater. Siden C. elegans er hermafroditter og selvbefruktning, krever standard overlevelsesanalyser at voksne dyr kontinuerlig flyttes bort fra deres avkom for å unngå forurensning fra avkom. Ikke bare er denne prosessen tidkrevende, den kan bli dyr på grunn av nødvendigheten av omtrent 100 plater per tilstand for å kjøre en enkelt levetidsanalyse. Her er to alternativer gitt: utnyttelse av den temperaturfølsomme germline-mindre mutanten, glp-4 (bn2), eller kjemisk sterilisering ved bruk av 5-fluoro-2′-deoksyuridin (FUDR). glp-4 koder for en valylaminoacyl-tRNA-syntetase, og den temperaturfølsomme glp-4(bn2) er reproduktivt mangelfull ved restriktive temperaturer på grunn av redusert proteinoversettelse30,31. FUDR er en robust metode for kjemisk sterilisering av C. elegans ved å forhindre DNA-replikasjon, og dermed hemme reproduksjon32. Selv om FUDR kan være uoverkommelig dyrt for noen laboratorier, er det bare en liten mengde som kreves for å sterilisere ormer kjemisk, og stabiliteten i pulverform kan gjøre det mulig for de fleste grupper. Å bruke den temperaturfølsomme glp-4 (bn2) mutanten er absolutt det billigste alternativet, da det eneste kravet er en inkubator for å skifte dyrene til de restriktive 25 ° C; Det skal imidlertid bemerkes at vekst ved 25 °C kan forårsake mild varmestress33,34. Uansett metode kan bruk av sterile dyr redusere kostnadene for forbruksvarer som kreves for aldersrelaterte analyser.
For å studere aldring er standard levetidsanalyser konvensjonelle, da paradigmer som endrer levetiden har direkte innvirkning på aldring. Målinger av helsespan og stresstoleranse gir imidlertid ytterligere informasjon om organismenes helse. Her tilbys flere metoder for å måle healthspan: 1) fecundity som et mål på reproduktiv helse; 2) brødstørrelse som et mål på utviklingshelse og levedyktighet av lagt avkom; og 3) lokomotorisk oppførsel som et mål på muskelfunksjon og motilitet, som begge er direkte korrelert med aldring. I tillegg tilbys analyser av stresstoleranse: overlevelse til ER-stress, mitokondrielt / oksidativt stress og termisk stressoverlevelse. Faktisk viser dyr med økt motstand mot ER-stress35,36, mitokondrielt stress37 og termisk stress38 økt levetid. ER-stress påføres ved å utsette C. elegans for tunicamycin, som blokkerer N-bundet glykosylering og forårsaker akkumulering av feilfoldede proteiner39. Mitokondrielt/oksidativt stress induseres ved eksponering for paraquat, som induserer superoksiddannelse spesielt i mitokondriene40. Varmestress påføres ved inkubering av dyr ved 34-37 °C 33,41. Alle analysene som er beskrevet her, kan utføres med minimalt utstyr og midler, og tilbyr en rekke verktøy for å studere aldring i ulike grupper.
Levetid, mest enkelt definert som livets varighet, er et klart binært fenomen i de fleste organismer – enten en organisme lever eller ikke. Lang levetid korrelerer imidlertid ikke alltid med en organismes helse. For eksempel er mitokondrielle hormesismodeller der eksponering for mitokondrielt stress dramatisk øker levetiden generelt noen av de lengstlevende dyrene, men viser forkrøplet vekst og redusert metabolsk funksjon37,54. På samme måte viser dyr med hyperaktive endoplasmatiske retikulumstressresponser også visse atferd og fenotyper som kan korreleres med redusert helse, til tross for at de har dramatisk forbedret proteinhomeostase og levetid36,49. Endelig er mange levetidsparadigmer i modellorganismer, inkludert økt HSF-1-funksjon55, økt XBP-1-funksjon56 og endret FoxO-signalering57, alle korrelert med økt kreftrisiko, og det er ubestridelig at forlenget levetid ikke er gunstig hvis en organisme er i konstant kamp med kreft og andre helsesykdommer. Derfor kan lang levetid ikke være en frittstående måling i aldrende biologi.
Dermed har begrepet healthspan vært et voksende felt i aldrende biologi. Healthspan, løst definert som den perioden av livet som man er sunn, er vanskeligere å fastslå enn lang levetid. Imidlertid, i motsetning til lang levetid, er begrepet “helse” komplisert, da det er mange forskjellige avlesninger for organismenes helse: på organismenivå er det muskelfunksjon / styrke, nevronal / kognitiv funksjon, reproduktiv helse, etc.; På mobilnivå er det proteinhomeostase, lipidhomeostase, glukosehomeostase, metabolisme, etc. I 2014 har aldrende biologer definitivt karakterisert biologiske kjennetegn ved aldring med den strukturerte definisjonen at det må være noe som naturlig brytes ned under aldring og kan eksperimentelt endres slik at eksperimentell forverring bør akselerere aldring og eksperimentell intervensjon bør bremse aldring. Disse ni kjennetegnene ved aldring inkluderer genomisk ustabilitet, telomerslitasje, epigenetiske endringer, tap av proteinhomeostase (proteostase), stamcelleutmattelse, endret intercellulær signalering, mitokondriell dysfunksjon, deregulert næringssensor og cellulær senescens58. Siden da hevder mange studier at andre faktorer bør inkluderes, inkludert ekstracellulære proteiner og systemisk fysiologi som immunitet og betennelse59. Til syvende og sist krever den komplekse definisjonen av healthspan at organismenes helse måles ved hjelp av flere forskjellige metoder.
I dette manuskriptet presenteres derfor flere metoder for å måle ulike aspekter ved healthspan ved hjelp av nematodemodellen C. elegans. Vi analyserer lokomotorisk oppførsel ved hjelp av thrashing analyser, reproduktiv helse ved hjelp av egg teller og brød størrelse, og følsomhet for stress. Faktisk er lokomotorisk oppførsel en gullstandardmetode for måling av healthspan, da organismer utviser betydelig tap av motilitet og bevegelse under aldring51. Tap av bevegelsesadferd kan tilskrives flere kjennetegn ved aldring, da muskelfunksjon i C. elegans er avhengig av riktig proteostase60, mitokondriell dysfunksjon61 og nevronmuskelsignalering62. Mens dette manuskriptet fokuserer på en måling av bevegelsesadferd, er det viktig å merke seg at mange andre metoder eksisterer, inkludert motilitet hos dyr på en solid agarplate, respons på berøring51 og kjemotaksisanalyser63. Imidlertid krever disse metodene generelt mer sofistikerte opptaksenheter, bruk av ormsporingsprogramvare eller bruk av dyre, farlige eller flyktige kjemikalier, som alle kan være uoverkommelige i enkelte forskningsinnstillinger.
I tillegg presenteres analyser for eggtelling og brødstørrelse som en metode for måling av reproduktiv helse og som den enkleste metoden for å måle celledeling i voksne ormer, siden voksne ormer er post-mitotiske og bare kimceller og embryoer gjennomgår celledeling i en voksen orm64. Som et mål på celledeling kan reproduktiv helse være relevant for de aldrende kjennetegnene ved cellulær senescens og stamcelleutmattelse. Reproduktiv helse kan påvirkes av mange faktorer, inkludert patogen infeksjon65 eller eksponering for stress49, selv om det ikke er noen direkte sammenheng mellom reproduktiv helse og lang levetid. Faktisk viser noen langlivede dyr en betydelig reduksjon i brødstørrelse49, og det er til og med mulig at det eksisterer en omvendt sammenheng mellom levetid og brødstørrelse50. Dette er ikke et fenomen som er spesifikt for C. elegans, da skadelige effekter av reproduksjon på lang levetid lenge har blitt observert hos mennesker66,følgesvenner 67 og mus68. Likevel gir vi eggtelling og brødstørrelse som en pålitelig og billig metode for å måle reproduktiv helse med forbehold om at reproduktiv helse kanskje ikke korrelerer med lang levetid eller helse.
Til slutt tilbys overlevelsesanalyser som et indirekte mål på organismenes helse. Det er viktig at cellulære stressresponser, inkludert respons på termisk stress69 og ER-stress35, raskt avtar under aldringsprosessen og har direkte relevans for det aldrende kjennetegnet for proteostase70,71. I motsetning til dette kan hyperaktiverende stressresponser øke levetiden betydelig ved å fremme motstandskraft mot stress 35,37,38. Mens denne studien fokuserer på de enkleste og laveste kostnadsmetodene, finnes det et stort antall alternative metoder for stressmotstandsanalyser for termotolerans41 og oksidativt stress66, som hver krever et annet sett med utstyr og forbruksvarer. Utover enkle eksponeringsstudier for stressorer, kan andre fysiologiske metoder utføres avhengig av tilgang til utstyr. For eksempel kan en ekstracellulær fluksanalysator overvåke mitokondriell funksjon og cellulær respirasjon73; fluorescerende disseksjonsmikroskoper vil tillate målinger av transkripsjonsreportere for aktivering av stressrespons20; og høyoppløselige sammensatte eller konfokale mikroskoper kan brukes til å måle organellmorfologi med fluorescerende prober for mitokondrier74, endoplasmatisk retikulum 75,76 og aktincytoskelett77.
Som en siste advarsel for målinger av lang levetid, mens kjemiske og genetiske metoder for sterilisering av ormer tilbys å redusere kostnadene betydelig, er det viktig å merke seg at begge kan påvirke levetiden direkte. For eksempel er eksponering for FUDR tidligere rapportert å påvirke både levetid og termotolerans45. Og mens glp-4 (bn2) mutanten i seg selv ikke har noen direkte effekter på levetiden, er vekst ved 25 ° C en mild varmespenning33,34 og kan dermed påvirke levetiden2. Det finnes andre metoder for sterilisering av C. elegans, inkludert auxinmediert sterilitet78 eller alternative temperaturfølsomme sperm-mangelfulle mutanter79. Imidlertid har alle metoder noen forbehold, og det bør tas hensyn til å utnytte den minst skadelige analysen for hvert laboratoriums vitenskapelige behov. En siste begrensning av levetidsstudier er potensiell variabilitet som kan oppstå på grunn av lave utvalgsstørrelser eller bare ved en objektiv feil av etterforskeren. Dette kan omgås ettersom ny teknologi er født i automatiserte levetidsteknologier80, men igjen er disse systemene kostbare og krever noe ingeniør- og beregningsutstyr og ferdigheter. Til syvende og sist er samlingen av metoder som tilbys her et pålitelig sett med verktøy som raskt kan tilpasses og læres i nesten hvilken som helst institusjon og gir et solid grunnlag for aldringsbiologi.
The authors have nothing to disclose.
G.G. støttes av T32AG052374 og R.H.S. støttes av R00AG065200 fra National Institute on Aging. Vi takker CGC (finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) for belastningene.
APEX IPTG | Genesee | 18-242 | for RNAi |
Bacto Agar | VWR | 90000-764 | for NGM plates |
Bacto Peptone | VWR | 97064-330 | for NGM plates |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | for NGM plates |
Carbenicillin | VWR | 76345-522 | for RNAi |
Cholesterol | VWR | 80057-932 | for NGM plates |
DMSO | VWR | BDH1115-1LP | solvent for drugs |
LB Broth | VWR | 95020-778 | for LB |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | 97062-132 | for NGM plates, M9 |
Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | for oxidative/mitochondrial stress |
Potassium Chloride | VWR | 97061-566 | for bleach soluton |
Potassium phosphate dibasic | VWR | EM-PX1570-2 | for NGM plates |
Potassium phosphate monobasic | VWR | EM-PX1565-5 | for M9 |
S7E Dissecting Scope | Leica | 10450840 | Standard dissecting microscope |
Sodium Chloride | VWR | EM-SX0420-5 | for NGM plates, M9 |
Sodium hypochlorite | VWR | RC7495.7-32 | for bleach solution |
Sodium phosphate dibasic | VWR | 71003-472 | for M9 |
Tetracycline hydrochloride | VWR | 97061-638 | for RNAi |
Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | for ER stress |