Het huidige protocol beschrijft lipidensuppletiemethoden in vloeibare en on-plate culturen voor Caenorhabditis elegans, in combinatie met longitudinale studies en gentranscriptionele analyse van bulk of een paar wormen en wormweefsels.
Veroudering is een complex proces dat wordt gekenmerkt door progressieve fysiologische veranderingen als gevolg van zowel omgevings- als genetische bijdragen. Lipiden zijn cruciaal bij het vormen van structurele componenten van celmembranen, het opslaan van energie en als signaalmoleculen. Regulatie van lipidemetabolisme en signalering is essentieel om verschillende levensduurroutes te activeren. De spoelworm Caenorhabditis elegans is een uitstekend en krachtig organisme om de bijdrage van lipidemetabolisme en signalering in levensduurregulatie te ontleden. Meerdere onderzoeken hebben beschreven hoe dieetsuppletie van specifieke lipidemoleculen de levensduur van C. elegans kan verlengen; kleine verschillen in de suppletievoorwaarden kunnen echter reproduceerbaarheidsproblemen veroorzaken bij wetenschappers in verschillende laboratoria. Hier worden twee gedetailleerde suppletiemethoden voor C. elegans gerapporteerd met behulp van lipidensuppletie met bacteriën die op platen zijn gezaaid of bacteriële suspensie in vloeibare cultuur. Hierin worden ook de details gegeven om levensduurtests uit te voeren met levenslange lipidensuppletie en qRT-PCR-analyse met behulp van een hele wormlysaat of ontleedde weefsels afgeleid van een paar wormen. Met behulp van een combinatie van longitudinale studies en transcriptionele onderzoeken naar lipidensuppletie, bieden de voedingstests betrouwbare benaderingen om te ontleden hoe lipiden de levensduur en gezonde veroudering beïnvloeden. Deze methodologie kan ook worden aangepast voor verschillende benaderingen voor voedingsscreening om veranderingen in een subset van transcripten te beoordelen met behulp van een klein aantal ontleedde weefsels of een paar dieren.
Lipiden
Lipiden zijn kleine hydrofobe of amfipathische moleculen die oplosbaar zijn in organische oplosmiddelen, maar onoplosbaar in water 1,2. Verschillende lipidemoleculen onderscheiden zich van elkaar op basis van het aantal koolstofatomen in hun ketens, locatie, aantal dubbele bindingen en gebonden structuren, waaronder glycerol of fosfaten. Lipiden spelen een cruciale rol in en tussen verschillende cellen om organismale functies te reguleren, waaronder het vormen van membraanbilagen, het bieden van energieopslag en het fungeren als signaalmoleculen 3,4.
Ten eerste zijn lipiden structurele componenten van biologische membranen, waaronder het plasmamembraan en intracellulaire subcellulaire membranen die de interne compartimenten scheiden van de extracellulaire omgeving. Ten tweede zijn lipiden de belangrijkste vorm van energieopslag bij gewervelde en ongewervelde dieren. Neutrale lipiden, waaronder triacylglycerolen, worden gedurende een langere periode opgeslagen in verschillende weefsels, waaronder in vetweefsel. In de nematode Caenorhabditis elegans is de darm het belangrijkste metabole vetopslagorgaan; de functie ervan is niet alleen betrokken bij de spijsvertering en absorptie van voedingsstoffen, maar ook bij het proces van ontgifting, dat lijkt op de activiteit van hepatocyten van zoogdieren. Andere vetopslagweefsels omvatten de kiembaan, waarin lipiden essentieel zijn voor het ontwikkelen van eicellen, en de hypodermis, die bestaat uit huidachtige epidermale cellen 3,5. Ten derde is er de laatste jaren meer bewijs dat lipiden krachtige signaalmoleculen zijn die betrokken zijn bij intra- en extracellulaire signalering door direct in te werken op een verscheidenheid aan receptoren, waaronder G-eiwitgekoppelde en nucleaire receptoren, of indirect via membraanfluïditeitsmodulatie of posttranslationele modificaties 6,7,8,9 . Verdere studies zullen doorgaan met het ophelderen van de onderliggende moleculaire mechanismen van lipidesignalering bij het bevorderen van een lang leven en de gezondheid.
Modelorganismen zijn belangrijk om specifieke biologische vragen aan te pakken die te complex zijn om bij mensen te bestuderen. De spoelworm C. elegans is bijvoorbeeld een uitstekend model voor het uitvoeren van genetische analyse om biologische processen te ontleden die relevant zijn voor menselijke voeding en ziekte10. De sterk geconserveerde moleculaire paden die relevant zijn voor de menselijke fysiologie, complexe weefsels, gedragspatronen en overvloedige genetische manipulatietools maken C. elegans een opmerkelijk modelorganisme11. C. elegans is bijvoorbeeld uitstekend in het doorsturen van genetische schermen om fenotype-specifieke genen te identificeren, evenals in genoombrede omgekeerde genetische schermen via RNA-interferentie12.
In laboratoria worden de nematoden gekweekt op agar petriplaten bezaaid met een gazon van Escherichia coli-bacteriën, die macronutriënten zoals eiwitten, koolhydraten en verzadigde en onverzadigde vetzuren leveren als bronnen van energie en bouwstenen, en micronutriënten zoals co-factoren envitamines 13. Net als bij zoogdieren synthetiseren nematoden vetzuurmoleculen uit zowel palmitinezuur als stearinezuur (respectievelijk verzadigde 16-koolstof- en 18-koolstofmoleculen) die sequentieel verzadigd en langwerpig zijn tot een verscheidenheid aan enkelvoudig onverzadigde vetzuren (MUFA’s) en meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA’s)14,15,16,17,18. Interessant is dat C. elegans in staat is tot de novo synthese van alle vereiste vetzuren en kernenzymen die betrokken zijn bij de biosynthese, desaturatie en rek van vetzuren, waardoor de synthese van pufa’s met langeketens wordt vergemakkelijkt 19. Anders dan andere diersoorten kan C. elegans 18-koolstof en 20-koolstof ω-6 vetzuren omzetten in ω-3 vetzuren met zijn eigen ω-3 desaturase enzymen. Bovendien bezitten wormen een Δ12-desaturase dat de vorming van linolzuur (LA) uit oliezuur katalyseert (OA, 18:1)20,21. De meeste dieren of planten missen zowel Δ12- als ω-3-desaturasen en zijn dus afhankelijk van de inname via de voeding van ω-6 en ω-3 om hun PUFA’s te verkrijgen, terwijl C. elegans geen voedingsvetzuren nodig heeft22. Geïsoleerde mutanten zonder functionele desaturase-enzymen zijn gebruikt om de functies van specifieke vetzuren in verschillende biologische processen te bestuderen, waaronder reproductie, groei, levensduur en neurotransmissie. Het effect van individuele vetzuren op specifieke biologische routes kan worden aangepakt met behulp van zowel een genetische benadering als voedingssuppletie 16,17,23. Tot op heden heeft lipidenonderzoek zich gericht op het karakteriseren van genen die betrokken zijn bij de lipidesynthese, afbraak, opslag en afbraak in neurologische en ontwikkelingsstoornissen24. De rol van lipiden in de regulering van de levensduur begint echter net te worden onthuld.
Lipide signalering bij levensduurregulatie
Lipiden spelen een cruciale rol bij de regulering van de levensduur door cellulaire signaleringscascades in verschillende weefsels en celtypen te activeren. Recente studies hebben de actieve rol van lipiden benadrukt bij het moduleren van transcriptie en cel-celcommunicatie via lipidebindende eiwitten of herkenning van membraanreceptoren25. Bovendien biedt lipidensuppletie in de voeding een uitstekend hulpmiddel om te ontleden hoe het lipidenmetabolisme de levensduur in C. elegans beïnvloedt. Van verschillende MUFA’s en PUFA’s is aangetoond dat ze de levensduur bevorderen door transcriptiefactoren 26,27 te activeren.
Levensduurmodellen, waaronder de insuline/IGF-1-signalering en de ablatie van kiembaanvoorlopercellen, zijn geassocieerd met de MUFA-biosyntheseroute en MUFA-suppletie, inclusief oliezuur, palmitoleïnezuur en cis-vacceenzuur, is voldoende om de levensduur van C. elegans te verlengen26. Hoewel het levensduureffect van de MUFA-administratie verder onderzoek vereist, zal het onderliggende mechanisme waarschijnlijk worden gemedieerd door de SKN-1 / Nrf2-transcriptiefactor, die een belangrijke activator is van oxidatieve stressrespons en levensduurregulatie28,29. Onder MUFA’s speelt een bepaalde klasse van vetacylethanolamiden genaamd N-acylethanolamines (NAE’s) een cruciale rol in verschillende mechanismen, waaronder ontsteking, allergieën, leren, geheugen en energiemetabolisme30. Met name het lipidemolecuul dat bekend staat als oleoylethanolamide (OEA) is geïdentificeerd als een positieve regulator van de levensduur door de translocatie van het lipidebindende eiwit 8 (LBP-8) in de kern te bevorderen om de nucleaire hormoonreceptoren NHR-49 en NHR-807 te activeren. Suppletie van het OEA analoge KDS-5104 is voldoende om de levensduur te verlengen en induceert de expressie van genen die betrokken zijn bij oxidatieve stressreacties en mitochondriale β-oxidatie 7,8.
Tegelijkertijd is de rol van PUFA’s ook gekoppeld aan regulering van de levensduur. Toediening van PUFA ω-3 vetzuur α-linoleenzuur (ALA) bevordert de levensduur door de NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF transcriptiefactoren te activeren en mitochondriale β-oxidatie te induceren31. Interessant is dat geperoxideerde producten van ALA, aangeduid als oxylipines, SKN-1 / NRF activeren, wat suggereert dat zowel PUFA’s als hun oxidatieve derivaten voordelen voor de levensduur kunnen opleveren23. Suppletie van ω-6 vetzuur arachidonzuur (AA) en dihomo-γ-linoleenzuur (DGLA) verlengt de levensduur via autofagie-activering, bevordert de kwaliteitscontrole van eiwitten en resulteert in de afbraak van verspilde en toxische eiwitaggregaten27,32. Meer recent is aangetoond dat een cel-niet-autonome signaleringsregulatie gemedieerd door het lipidebindende eiwit 3 (LBP-3) en DGLA cruciaal is voor het bevorderen van de levensduur door perifere signalen naar neuronen te sturen, wat een langeafstandsrol van lipidemoleculen in interweefselcommunicatie op systemische niveaussuggereert 33. De huidige studie rapporteert elke stap om lipidensuppletie uit te voeren met bacteriën die op platen zijn gezaaid of bacteriële suspensie in vloeibare cultuur. Deze methodologieën worden gebruikt om de levensduur en transcriptionele analyse te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de inhoud van het hele lichaam of ontleedde weefsels die zijn afgeleid van een paar wormen. De volgende technieken kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid aan voedingsstudies en bieden een geldig hulpmiddel om te ontleden hoe lipidemetabolisme de levensduur en gezond ouder worden beïnvloedt.
Lipidensuppletie is gebruikt in verouderingsonderzoek om de directe impact van bepaalde lipidensoorten op gezond ouder worden op te helderen 6,7,23,26,27,31. De lipidensuppletieprocedure kan echter een uitdaging zijn en elke inconsistentie tussen experimenten kan niet-reproduceerbare resultaten veroorzaken. Hier wordt het ee…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken P. Svay voor de onderhoudsondersteuning. Dit werk werd ondersteund door NIH-beurzen R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI-onderzoeker (M.C.W.) en NIH T32 ES027801 predoctorale student fellow (MS). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
1.5 mL Pestle | Genesee Scientific | 93-165P15 | For worm grinding with Trizol |
Agarose | Sigma | A9639-500G | |
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | For reverse transcription from bulk worm samples |
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | For qRT-PCR |
Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1248 | For spin down PCR tubes |
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
Eppendorf 5424 R centrifuge | Eppendorf | 22620444R | For RNA extraction |
Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | For reverse transcription |
Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate | Neta Scientific | 665180 | 12-well plates for licuid feeding |
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates |
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | For worm6-cm NGM plates |
Invitrogen nuclease-free water | ThermoFisher | AM9937 | |
Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
Levamisole hydrochloride | VWR | SPCML1054 | |
lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
lipl-4Tg;fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
Luria Broth Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode | ThermoFisher | 4483354 | 96-well qPCR plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied BioSystem | 4311971 | For sealing the 96-well qPCR plate |
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System | Sigma | Z00Q0V0WW | Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol |
N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | N/A | For measuring RNA concentration |
OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Bacteria used as C. elegans food |
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
Power SYBR Green cells-to-Ct kit | ThermoFisher | 4402953 | For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue |
Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | For qPCR from bulk worm samples |
Pure Bright germicidal ultra bleach | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% house bleach For worm egg preparation |
Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | Watch glass for dissecting the worms |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | ThermoFisher | AM9780 | |
Sodium cloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge | Thermo | 7500-4337 | For bacteria collection |
Thermo Sorvall ST 8 centrifuge | Thermo | 7500-7200 | For worm egg preparation |
TRIzol Reagent | TheroFisher | 15596018 | RNA extraction reagent |
Turbo DNA-free kit | ThermoFisher | AM1907 | For removing DNA contamination in RNA extractions |
Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor | VWR | 47747-370 | For worm grinding with Trizol |
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 | VWR | N/A | For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064 |
Worm picker | WormStuff | 59-AWP |