Lipidsupplementierung für Langlebigkeit und Gentranskriptionsanalyse bei Caenorhabditis elegans
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt Lipidergänzungsmethoden in Flüssig- und On-Plate-Kulturen für Caenorhabditis elegans, gekoppelt mit Längsschnittstudien und Gentranskriptionsanalysen von Massen oder einigen wenigen Würmern und Wurmgeweben.
Abstract
Das Altern ist ein komplexer Prozess, der durch fortschreitende physiologische Veränderungen gekennzeichnet ist, die sowohl aus Umwelt- als auch aus genetischen Beiträgen resultieren. Lipide sind entscheidend für die Bildung struktureller Bestandteile von Zellmembranen, die Speicherung von Energie und als Signalmoleküle. Die Regulierung des Fettstoffwechsels und der Signalübertragung ist unerlässlich, um unterschiedliche Langlebigkeitswege zu aktivieren. Der Spulwurm Caenorhabditis elegans ist ein ausgezeichneter und leistungsfähiger Organismus, um den Beitrag des Fettstoffwechsels und der Signalübertragung zur Langlebigkeitsregulation zu analysieren. Mehrere Forschungsstudien haben beschrieben, wie die Nahrungsergänzung spezifischer Lipidmoleküle die Lebensdauer von C. elegans verlängern kann; Geringfügige Unterschiede in den Ergänzungsbedingungen können jedoch zu Reproduzierbarkeitsproblemen bei Wissenschaftlern in verschiedenen Labors führen. Hier werden zwei detaillierte Supplementierungsmethoden für C. elegans berichtet, die eine Lipidsupplementierung entweder mit Bakterien, die auf Platten ausgesät werden, oder mit Bakteriensuspension in flüssiger Kultur verwenden. Ebenfalls hierin enthalten sind die Details zur Durchführung von Lebensdauer-Assays mit lebenslanger Lipidsupplementierung und qRT-PCR-Analyse unter Verwendung eines ganzen Wurmlysats oder seziertem Gewebe, das von einigen Würmern stammt. Unter Verwendung einer Kombination aus Längsschnittstudien und transkriptionellen Untersuchungen zur Lipidsupplementierung liefern die Fütterungsassays zuverlässige Ansätze, um zu analysieren, wie Lipide die Langlebigkeit und das gesunde Altern beeinflussen. Diese Methodik kann auch für verschiedene Ernährungs-Screening-Ansätze angepasst werden, um Veränderungen in einer Teilmenge von Transkripten entweder mit einer kleinen Anzahl von sezierten Geweben oder einigen Tieren zu bewerten.
Introduction
Lipide
Lipide sind kleine hydrophobe oder amphipathische Moleküle, die in organischen Lösungsmitteln löslich, aber in Wasser unlöslichsind 1,2. Unterschiedliche Lipidmoleküle unterscheiden sich voneinander basierend auf der Anzahl der in ihren Ketten enthaltenen Kohlenstoffe, der Lage, der Anzahl der Doppelbindungen und der gebundenen Strukturen, einschließlich Glycerin oder Phosphaten. Lipide spielen eine entscheidende Rolle innerhalb und zwischen verschiedenen Zellen, um organismische Funktionen zu regulieren, einschließlich der Bildung von Membrandoppelschichten, der Bereitstellung von Energiespeicherung und der Funktion als Signalmoleküle 3,4.
Erstens sind Lipide strukturelle Bestandteile biologischer Membranen, einschließlich der Plasmamembran und intrazellulärer subzellulärer Membranen, die die inneren Kompartimente von der extrazellulären Umgebung trennen. Zweitens sind Lipide die wichtigste Form der Energiespeicherung bei Wirbeltieren und wirbellosen Tieren. Neutrale Lipide, einschließlich Triacylglycerine, werden über einen längeren Zeitraum in verschiedenen Geweben, einschließlich im Fettgewebe, gespeichert. Beim Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist der Darm das wichtigste metabolische Fettspeicherorgan; Seine Funktion ist nicht nur an der Verdauung und Aufnahme von Nährstoffen beteiligt, sondern auch am Entgiftungsprozess, der der Aktivität von Säugetierhepatozyten ähnelt. Andere Fettspeichergewebe umfassen die Keimbahn, in der Lipide für die Entwicklung von Eizellen unerlässlich sind, und die Hypodermis, die aus hautähnlichen epidermalen Zellen besteht 3,5. Drittens haben in den letzten Jahren mehr Beweise dafür gezeigt, dass Lipide starke Signalmoleküle sind, die an der intra- und extrazellulären Signalübertragung beteiligt sind, indem sie direkt auf eine Vielzahl von Rezeptoren wirken, einschließlich G-Protein-gekoppelter und nukleärer Rezeptoren, oder indirekt über Membranfluiditätsmodulation oder posttranslationale Modifikationen 6,7,8,9 . Weitere Studien werden weiterhin die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Lipidsignalisierung zur Förderung von Langlebigkeit und Gesundheitsspanne aufklären.
Modellorganismen sind wichtig, um spezifische biologische Fragen zu beantworten, die zu komplex sind, um sie am Menschen zu untersuchen. Zum Beispiel ist der Spulwurm C. elegans ein hervorragendes Modell für die Durchführung genetischer Analysen zur Analyse biologischer Prozesse, die für die menschliche Ernährung und Krankheit relevant sind10. Die hochkonservierten molekularen Signalwege, die für die menschliche Physiologie relevant sind, komplexe Gewebe, Verhaltensmuster und reichlich genetische Manipulationswerkzeuge machen C. elegans zu einem bemerkenswerten Modellorganismus11. Zum Beispiel eignet sich C. elegans hervorragend für die Weiterleitung genetischer Screens zur Identifizierung phänotypspezifischer Gene sowie für genomweite umgekehrte genetische Screens über RNA-Interferenz12.
In Laboratorien werden die Nematoden auf Agar-Petriplatten gezüchtet, die mit einem Rasen aus Escherichia coli-Bakterien besät sind und Makronährstoffe wie Proteine, Kohlenhydrate sowie gesättigte und ungesättigte Fettsäuren als Energiequellen und Bausteine sowie Mikronährstoffe wie Co-Faktoren und Vitamine13 liefern. Ähnlich wie Säugetiere synthetisieren Nematoden Fettsäuremoleküle sowohl aus Palmitinsäure als auch aus Stearinsäure (gesättigte 16-Kohlenstoff- bzw. 18-Kohlenstoffmoleküle), die sequentiell entsättigt und zu einer Vielzahl von einfach ungesättigten Fettsäuren (MUFAs) und mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) verlängert werden14,15,16,17,18. Interessanterweise ist C. elegans in der Lage, alle erforderlichen Fettsäuren und Kernenzyme de novo zu synthetisieren, die an der Fettsäurebiosynthese, -entsättigung und -verlängerung beteiligt sind, was die Synthese langkettiger PUFAs erleichtert19. Im Gegensatz zu anderen Tierarten kann C. elegans 18-Kohlenstoff- und 20-Kohlenstoff-ω-6-Fettsäuren mit eigenen ω-3-Desaturase-Enzymen in ω-3-Fettsäuren umwandeln. Zusätzlich besitzen Würmer eine Δ12-Desaturase, die die Bildung von Linolsäure (LA) aus Ölsäure katalysiert (OA, 18:1)20,21. Den meisten Tieren oder Pflanzen fehlen sowohl Δ12- als auch ω-3-Desaturasen und sind daher auf die Nahrungsaufnahme von ω-6 und ω-3 angewiesen, um ihre PUFAs zu erhalten, während C. elegans keine Nahrungsfettsäuren benötigt22. Isolierte Mutanten ohne funktionelle Desaturase-Enzyme wurden verwendet, um die Funktionen spezifischer Fettsäuren in verschiedenen biologischen Prozessen zu untersuchen, einschließlich Fortpflanzung, Wachstum, Langlebigkeit und Neurotransmission. Die Wirkung einzelner Fettsäuren auf spezifische biologische Signalwege kann sowohl durch einen genetischen Ansatz als auch durch Nahrungsergänzung behandelt werden16,17,23. Bisher konzentrierte sich die Lipidforschung auf die Charakterisierung von Genen, die an der Synthese, dem Abbau, der Speicherung und dem Abbau von Lipiden bei neurologischen und Entwicklungsbedingungen beteiligt sind24. Die Rolle von Lipiden bei der Langlebigkeitsregulation beginnt jedoch gerade erst, aufgedeckt zu werden.
Lipidsignalisierung in der Langlebigkeitsregulation
Lipide spielen eine entscheidende Rolle bei der Langlebigkeitsregulation, indem sie zelluläre Signalkaskaden in verschiedenen Geweben und Zelltypen aktivieren. Neuere Studien haben die aktive Rolle von Lipiden bei der Modulation der Transkription und Zell-Zell-Kommunikation über lipidbindende Proteine oder die Erkennung von Membranrezeptoren hervorgehoben25. Darüber hinaus bietet die Nahrungsergänzung mit Lipiden ein hervorragendes Werkzeug, um zu analysieren, wie der Fettstoffwechsel die Lebensdauer von C. elegans beeinflusst. Es wurde gezeigt, dass unterschiedliche MUFAs und PUFAs die Langlebigkeit fördern, indem sie die Transkriptionsfaktoren26,27 aktivieren.
Langlebigkeitsmodelle, einschließlich der Insulin / IGF-1-Signalisierung und der Ablation von Keimbahnvorläuferzellen, sind mit dem MUFA-Biosyntheseweg assoziiert, und eine MUFA-Supplementierung, einschließlich Ölsäure, Palmitoleinsäure und cis-Vaccen, reicht aus, um die Lebensdauer von C. elegans zu verlängern26. Obwohl der durch die MUFA-Verabreichung verliehene Langlebigkeitseffekt weitere Untersuchungen erfordert, wird der zugrunde liegende Mechanismus wahrscheinlich durch den SKN-1/Nrf2-Transkriptionsfaktor vermittelt, der ein Schlüsselaktivator der oxidativen Stressreaktion und der Langlebigkeitsregulationist 28,29. Unter MUFAs spielt eine bestimmte Klasse von Fettacylethanolamiden, die N-Acylethanolamine (NAEs), eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Mechanismen wie Entzündungen, Allergien, Lernen, Gedächtnis und Energiestoffwechsel30. Insbesondere wurde das als Oleoylethanolamid (OEA) bekannte Lipidmolekül als positiver Regulator der Langlebigkeit identifiziert, indem es die Translokation des lipidbindenden Proteins 8 (LBP-8) in den Zellkern fördert, um die nukleären Hormonrezeptoren NHR-49 und NHR-807 zu aktivieren. Die Supplementierung des OEA-Analogons KDS-5104 ist ausreichend, um die Lebensdauer zu verlängern, und induziert die Expression von Genen, die an oxidativen Stressreaktionen und mitochondrialer β-Oxidation beteiligt sind 7,8.
Gleichzeitig wurde die Rolle von PUFAs auch mit der Regulierung der Langlebigkeit in Verbindung gebracht. Die Verabreichung von PUFA ω-3-Fettsäuren α-Linolensäure (ALA) fördert die Langlebigkeit durch Aktivierung der NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF-Transkriptionsfaktoren und induziert mitochondriale β-Oxidation31. Interessanterweise aktivieren peroxidierte Produkte von ALA, die als Oxylipine bezeichnet werden, SKN-1 / NRF, was darauf hindeutet, dass sowohl PUFAs als auch ihre oxidativen Derivate Langlebigkeitsvorteile verleihen können23. Die Supplementierung von ω-6-Fettsäure Arachidonsäure (AA) und Dihomo-γ-Linolensäure (DGLA) verlängert die Lebensdauer durch Autophagieaktivierung, fördert die Proteinqualitätskontrolle und führt zum Abbau von verschwendeten und toxischen Proteinaggregaten27,32. In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass eine zellun-autonome Signalregulation, die durch das lipidbindende Protein 3 (LBP-3) und DGLA vermittelt wird, entscheidend für die Förderung der Langlebigkeit ist, indem periphere Signale an Neuronen gesendet werden, was auf eine weitreichende Rolle von Lipidmolekülen in der Kommunikation zwischen Geweben auf systemischer Ebene hindeutet33. Die vorliegende Studie berichtet über jeden Schritt, um eine Lipidsupplementierung mit Bakterien durchzuführen, die auf Platten oder Bakteriensuspension in flüssiger Kultur ausgesät werden. Diese Methoden werden verwendet, um die Lebensdauer und die Transkriptionsanalyse zu bewerten, wobei Ganzkörperinhalte oder seziertes Gewebe von einigen Würmern verwendet werden. Die folgenden Techniken können an eine Vielzahl von Ernährungsstudien angepasst werden und bieten ein gültiges Werkzeug, um zu analysieren, wie der Fettstoffwechsel die Langlebigkeit und das gesunde Altern beeinflusst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lipidergänzung wurde in der Alterungsforschung eingesetzt, um die direkten Auswirkungen bestimmter Lipidspezies auf gesundes Altern aufzuklären 6,7,23,26,27,31. Das Lipidergänzungsverfahren kann jedoch eine Herausforderung darstellen, und jede Inkonsistenz zwischen Experimenten kann zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen f?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken P. Svay für die Unterstützung bei der Wartung. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI Investigator (M.C.W.) und NIH T32 ES027801 Pre-doctoral Student Fellow (M.S.) unterstützt. Einige Stämme wurden vom CGC bereitgestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird.
Materials
| 1.5 mL Pestle | Genesee Scientific | 93-165P15 | For worm grinding with Trizol |
| Agarose | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | For reverse transcription from bulk worm samples |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | For qRT-PCR |
| Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1248 | For spin down PCR tubes |
| Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
| Eppendorf 5424 R centrifuge | Eppendorf | 22620444R | For RNA extraction |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | For reverse transcription |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate | Neta Scientific | 665180 | 12-well plates for licuid feeding |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | For worm6-cm NGM plates |
| Invitrogen nuclease-free water | ThermoFisher | AM9937 | |
| Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
| Levamisole hydrochloride | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| lipl-4Tg;fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| Luria Broth Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode | ThermoFisher | 4483354 | 96-well qPCR plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied BioSystem | 4311971 | For sealing the 96-well qPCR plate |
| Milli-Q Advantage A10 Water Purification System | Sigma | Z00Q0V0WW | Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol |
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | N/A | For measuring RNA concentration |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Bacteria used as C. elegans food |
| Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Power SYBR Green cells-to-Ct kit | ThermoFisher | 4402953 | For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue |
| Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | For qPCR from bulk worm samples |
| Pure Bright germicidal ultra bleach | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% house bleach For worm egg preparation |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | Watch glass for dissecting the worms |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | ThermoFisher | AM9780 | |
| Sodium cloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge | Thermo | 7500-4337 | For bacteria collection |
| Thermo Sorvall ST 8 centrifuge | Thermo | 7500-7200 | For worm egg preparation |
| TRIzol Reagent | TheroFisher | 15596018 | RNA extraction reagent |
| Turbo DNA-free kit | ThermoFisher | AM1907 | For removing DNA contamination in RNA extractions |
| Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor | VWR | 47747-370 | For worm grinding with Trizol |
| VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 | VWR | N/A | For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064 |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
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