Supplementazione lipidica per la longevità e analisi trascrizionale genica in Caenorhabditis elegans
Summary
Il presente protocollo descrive i metodi di integrazione lipidica in colture liquide e su piastra per Caenorhabditis elegans, accoppiati con studi longitudinali e analisi trascrizionali geniche da bulk o da pochi vermi e tessuti di vermi.
Abstract
L’invecchiamento è un processo complesso caratterizzato da progressivi cambiamenti fisiologici derivanti da contributi sia ambientali che genetici. I lipidi sono cruciali nel costituire componenti strutturali delle membrane cellulari, immagazzinare energia e come molecole di segnalazione. La regolazione del metabolismo lipidico e della segnalazione è essenziale per attivare percorsi di longevità distinti. Il nematode Caenorhabditis elegans è un organismo eccellente e potente per analizzare il contributo del metabolismo lipidico e della segnalazione nella regolazione della longevità. Diversi studi di ricerca hanno descritto come l’integrazione dietetica di specifiche molecole lipidiche può prolungare la durata della vita di C. elegans ; Tuttavia, piccole differenze nelle condizioni di integrazione possono causare problemi di riproducibilità tra gli scienziati in diversi laboratori. Qui, due metodi di integrazione dettagliati per C. elegans sono segnalati impiegando l’integrazione lipidica sia con batteri seminati su piastre o sospensione batterica in coltura liquida. Qui sono forniti anche i dettagli per eseguire saggi di durata della vita con supplementazione lipidica permanente e analisi qRT-PCR utilizzando un lisato di verme intero o tessuti sezionati derivati da alcuni vermi. Utilizzando una combinazione di studi longitudinali e indagini trascrizionali sull’integrazione lipidica, i saggi di alimentazione forniscono approcci affidabili per analizzare come i lipidi influenzano la longevità e l’invecchiamento sano. Questa metodologia può anche essere adattata per vari approcci di screening nutrizionale per valutare i cambiamenti in un sottoinsieme di trascrizioni utilizzando un piccolo numero di tessuti sezionati o alcuni animali.
Introduction
Lipidi
I lipidi sono piccole molecole idrofobiche o anfipatiche solubili in solventi organici ma insolubili in acqua 1,2. Le molecole lipidiche distinte si differenziano l’una dall’altra in base al numero di atomi di carbonio contenuti nelle loro catene, alla posizione, al numero di doppi legami e alle strutture legate, tra cui glicerolo o fosfati. I lipidi svolgono ruoli cruciali all’interno e attraverso cellule distinte per regolare le funzioni dell’organismo, tra cui la costituzione di doppi strati di membrana, fornendo accumulo di energia e agendo come molecole di segnalazione 3,4.
In primo luogo, i lipidi sono componenti strutturali delle membrane biologiche, compresa la membrana plasmatica e le membrane subcellulari intracellulari che dividono i compartimenti interni dall’ambiente extracellulare. In secondo luogo, i lipidi sono la principale forma di accumulo di energia negli animali vertebrati e invertebrati. I lipidi neutri, compresi i triacilgliceroli, sono immagazzinati per un lungo periodo in vari tessuti, incluso il tessuto adiposo. Nel nematode Caenorhabditis elegans, l’intestino è il principale organo metabolico di deposito del grasso; La sua funzione non è solo coinvolta nella digestione e nell’assorbimento dei nutrienti, ma anche nel processo di disintossicazione, che assomiglia all’attività degli epatociti dei mammiferi. Altri tessuti di accumulo di grasso includono la linea germinale, in cui i lipidi sono essenziali per lo sviluppo degli ovociti, e l’ipoderma, che è composto da cellule epidermiche simili alla pelle 3,5. In terzo luogo, negli ultimi anni, ulteriori prove hanno suggerito che i lipidi sono potenti molecole di segnalazione coinvolte nella segnalazione intra ed extracellulare agendo direttamente su una varietà di recettori, compresi i recettori accoppiati a proteine G e nucleari, o indirettamente attraverso la modulazione della fluidità della membrana o le modifiche post-traduzionali 6,7,8,9 . Ulteriori studi continueranno a chiarire i meccanismi molecolari alla base della segnalazione lipidica nel promuovere la longevità e la durata della salute.
Gli organismi modello sono importanti per affrontare specifiche questioni biologiche che sono troppo complesse da studiare negli esseri umani. Ad esempio, il nematode C. elegans è un modello eccellente per condurre analisi genetiche per sezionare i processi biologici rilevanti per la nutrizione umana e la malattia10. I percorsi molecolari altamente conservati rilevanti per la fisiologia umana, i tessuti complessi, i modelli comportamentali e gli abbondanti strumenti di manipolazione genetica rendono C. elegans un notevole organismo modello11. Ad esempio, C. elegans è eccellente nell’inoltro di screening genetici per identificare geni fenotipo-specifici, così come negli screening genetici inversi a livello di genoma tramite interferenza RNA12.
Nei laboratori, i nematodi vengono coltivati su piastre di agar Petri seminate con un prato di batteri Escherichia coli, fornendo macronutrienti come proteine, carboidrati e acidi grassi saturi e insaturi come fonti di energia e mattoni e micronutrienti come co-fattori e vitamine13. Analogamente ai mammiferi, i nematodi sintetizzano molecole di acidi grassi sia dall’acido palmitico che dall’acido stearico (molecole sature a 16 e 18 atomi di carbonio, rispettivamente) che sono sequenzialmente desaturate e allungate in una varietà di acidi grassi monoinsaturi (MUFA) e acidi grassi polinsaturi (PUFA)14,15,16,17,18. È interessante notare che C. elegans è in grado di sintetizzare de novo tutti gli acidi grassi necessari e gli enzimi principali coinvolti nella biosintesi, nella desaturazione e nell’allungamento degli acidi grassi, facilitando la sintesi di PUFA a catena lunga19. A differenza di altre specie animali, C. elegans può convertire gli acidi grassi ω-6 a 18 e 20 atomi di carbonio in acidi grassi ω-3 con i propri enzimi ω-3 desaturasi. Inoltre, i vermi possiedono una Δ12 desaturasi che catalizza la formazione di acido linoleico (LA) dall’acido oleico (OA, 18:1)20,21. La maggior parte degli animali o delle piante mancano sia di Δ12 che di ω-3 desaturasi e quindi si basano sull’assunzione alimentare di ω-6 e ω-3 per ottenere i loro PUFA, mentre C. elegans non richiede acidi grassi alimentari22. Mutanti isolati privi di enzimi desaturasi funzionali sono stati utilizzati per studiare le funzioni di specifici acidi grassi in processi biologici distinti, tra cui riproduzione, crescita, longevità e neurotrasmissione. L’effetto dei singoli acidi grassi su specifici percorsi biologici può essere affrontato utilizzando sia un approccio genetico che un’integrazione dietetica16,17,23. Ad oggi, la ricerca sui lipidi si è concentrata sulla caratterizzazione dei geni coinvolti nella sintesi, degradazione, conservazione e rottura dei lipidi nelle condizioni neurologiche e di sviluppo24. Tuttavia, i ruoli dei lipidi nella regolazione della longevità stanno appena iniziando a essere rivelati.
Segnalazione lipidica nella regolazione della longevità
I lipidi svolgono un ruolo cruciale nella regolazione della longevità attivando cascate di segnalazione cellulare in tessuti e tipi di cellule distinti. Studi recenti hanno evidenziato il ruolo attivo dei lipidi nella modulazione della trascrizione e della comunicazione cellula-cellula attraverso proteine leganti i lipidi o il riconoscimento dei recettori di membrana25. Inoltre, l’integrazione lipidica dietetica offre uno strumento eccellente per sezionare come il metabolismo lipidico influenza la durata della vita in C. elegans. È stato dimostrato che MUFA e PUFA distinti promuovono la longevità attivando i fattori di trascrizione26,27.
I modelli di longevità, tra cui la segnalazione insulina / IGF-1 e l’ablazione delle cellule precursori della linea germinale, sono associati alla via di biosintesi MUFA e l’integrazione di MUFA, tra cui acido oleico, acido palmitoleico e cis-vaccenic, è sufficiente per estendere la durata della vita di C. elegans 26. Sebbene l’effetto longevità conferito dalla somministrazione di MUFA richieda ulteriori indagini, è probabile che il meccanismo sottostante sia mediato dal fattore di trascrizione SKN-1 / Nrf2, che è un attivatore chiave della risposta allo stress ossidativo e della regolazione della longevità28,29. Tra i MUFA, una particolare classe di etanolammidi acili grasse chiamate N-aciletanolammine (NAE) svolge ruoli cruciali in meccanismi distinti tra cui infiammazione, allergie, apprendimento, memoria e metabolismo energetico30. In particolare, la molecola lipidica nota come oleoiletanolamide (OEA) è stata identificata come regolatore positivo della longevità promuovendo la traslocazione della proteina legante i lipidi 8 (LBP-8) nel nucleo per attivare i recettori ormonali nucleari NHR-49 e NHR-807. L’integrazione dell’analogo OEA KDS-5104 è sufficiente per prolungare la durata della vita e induce l’espressione di geni coinvolti nelle risposte allo stress ossidativo e nella β-ossidazione mitocondriale 7,8.
Allo stesso tempo, il ruolo dei PUFA è stato anche collegato alla regolamentazione della longevità. La somministrazione di acido grasso PUFA ω-3 acido α-linolenico (ALA) promuove la longevità attivando i fattori di trascrizione NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF e inducendo la β-ossidazione mitocondriale31. È interessante notare che i prodotti perossidati di ALA, indicati come ossilipine, attivano SKN-1 / NRF, suggerendo che sia i PUFA che i loro derivati ossidativi possono conferire benefici di longevità23. L’integrazione dell’acido grasso ω-6 acido arachidonico (AA) e dell’acido diomo-γ-linolenico (DGLA) prolunga la durata della vita attraverso l’attivazione dell’autofagia, promuovendo il controllo della qualità delle proteine e determinando la degradazione degli aggregati proteici sprecati e tossici27,32. Più recentemente, una regolazione del segnale cellulare non autonoma mediata dalla proteina legante i lipidi 3 (LBP-3) e DGLA ha dimostrato di essere cruciale per promuovere la longevità inviando segnali periferici ai neuroni, suggerendo un ruolo a lungo raggio delle molecole lipidiche nella comunicazione intertissutale a livelli sistemici33. Il presente studio riporta ogni fase per eseguire l’integrazione lipidica con batteri seminati su piastre o sospensione batterica in coltura liquida. Queste metodologie sono utilizzate per valutare la durata della vita e l’analisi trascrizionale, impiegando il contenuto di tutto il corpo o tessuti sezionati derivati da alcuni vermi. Le seguenti tecniche possono essere adattate a una varietà di studi nutrizionali e offrono un valido strumento per analizzare come il metabolismo lipidico influenza la longevità e l’invecchiamento sano.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’integrazione lipidica è stata impiegata nella ricerca sull’invecchiamento per chiarire l’impatto diretto di alcune specie lipidiche sull’invecchiamento sano 6,7,23,26,27,31. Tuttavia, la procedura di integrazione lipidica può essere impegnativa e qualsiasi incoerenza tra gli esperimenti può causare risultati non riproduc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo P. Svay per il supporto alla manutenzione. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI investigator (MCW) e NIH T32 ES027801 pre-doctoral student fellow (MS). Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall’Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440).
Materials
| 1.5 mL Pestle | Genesee Scientific | 93-165P15 | For worm grinding with Trizol |
| Agarose | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | For reverse transcription from bulk worm samples |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | For qRT-PCR |
| Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1248 | For spin down PCR tubes |
| Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
| Eppendorf 5424 R centrifuge | Eppendorf | 22620444R | For RNA extraction |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | For reverse transcription |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate | Neta Scientific | 665180 | 12-well plates for licuid feeding |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | For worm6-cm NGM plates |
| Invitrogen nuclease-free water | ThermoFisher | AM9937 | |
| Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
| Levamisole hydrochloride | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| lipl-4Tg;fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| Luria Broth Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode | ThermoFisher | 4483354 | 96-well qPCR plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied BioSystem | 4311971 | For sealing the 96-well qPCR plate |
| Milli-Q Advantage A10 Water Purification System | Sigma | Z00Q0V0WW | Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol |
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | N/A | For measuring RNA concentration |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Bacteria used as C. elegans food |
| Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Power SYBR Green cells-to-Ct kit | ThermoFisher | 4402953 | For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue |
| Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | For qPCR from bulk worm samples |
| Pure Bright germicidal ultra bleach | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% house bleach For worm egg preparation |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | Watch glass for dissecting the worms |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | ThermoFisher | AM9780 | |
| Sodium cloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge | Thermo | 7500-4337 | For bacteria collection |
| Thermo Sorvall ST 8 centrifuge | Thermo | 7500-7200 | For worm egg preparation |
| TRIzol Reagent | TheroFisher | 15596018 | RNA extraction reagent |
| Turbo DNA-free kit | ThermoFisher | AM1907 | For removing DNA contamination in RNA extractions |
| Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor | VWR | 47747-370 | For worm grinding with Trizol |
| VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 | VWR | N/A | For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064 |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
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