カエノラブディティス・エレガンスにおける長寿と遺伝子転写解析のための脂質補給
Summary
本プロトコルは、 カエノラブディティスエレガンスの液体およびオンプレート培養における脂質補給方法を、バルクまたは少数のワームおよびワーム組織からの縦断的研究および遺伝子転写分析と組み合わせて説明しています。
Abstract
老化は、環境的および遺伝的寄与の両方に起因する進行性の生理学的変化を特徴とする複雑なプロセスです。脂質は、細胞膜の構造成分を構成し、エネルギーを蓄え、シグナル伝達分子として極めて重要です。脂質代謝とシグナル伝達の調節は、明確な長寿経路を活性化するために不可欠です。回虫 Caenorhabditis elegans は、長寿調節における脂質代謝とシグナル伝達の寄与を解剖するための優れた強力な生物です。複数の調査研究により、特定の脂質分子の食事補給がどのように C.エレガンス の寿命を延ばすことができるかが説明されています。ただし、補充条件のわずかな違いは、異なる研究室の科学者間で再現性の問題を引き起こす可能性があります。ここでは、プレートに播種した細菌または液体培養中の細菌懸濁液のいずれかを用いた脂質補給を採用した C.elegans の2つの詳細な補充方法を報告する。また、全線虫溶解物または少数の線虫由来の解剖組織を用いて生涯脂質補給およびqRT−PCR分析を伴う寿命アッセイを実行するための詳細も本明細書に提供される。脂質補給時の縦断的研究と転写調査を組み合わせて使用 することで、脂質が長寿と健康的な老化にどのように影響するかを分析するための信頼できるアプローチを提供します。この方法論は、少数の解剖組織または少数の動物のいずれかを使用して転写産物のサブセットの変化を評価するための様々な栄養スクリーニングアプローチにも適用することができる。
Introduction
脂質
脂質は、有機溶媒に可溶であるが水には不溶性の小さな疎水性または両親媒性分子である1,2。異なる脂質分子は、それらの鎖に含まれる炭素の数、位置、二重結合の数、およびグリセロールまたはリン酸塩を含む結合構造に基づいて互いに区別します。脂質は、膜二重層の構成、エネルギー貯蔵の提供、シグナル伝達分子としての作用など、生物機能を調節するために、異なる細胞内および細胞間で重要な役割を果たします3,4。
まず、脂質は、細胞外環境から内部区画を隔てる原形質膜や細胞内膜を含む生体膜の構造成分である。第二に、脂質は脊椎動物および無脊椎動物のエネルギー貯蔵の主要な形態です。トリアシルグリセロールを含む中性脂質は、脂肪組織を含む様々な組織に長期間貯蔵される。線虫のカエノラブディティスエレガンスでは、腸は主要な代謝脂肪貯蔵器官です。その機能は、栄養素の消化と吸収だけでなく、哺乳類の肝細胞の活動に似た解毒の過程にも関与しています。他の脂肪貯蔵組織には、卵母細胞の発達に脂質が必須である生殖細胞系列、および皮膚様表皮細胞で構成される皮下組織が含まれます3,5。第三に、近年、脂質は、Gタンパク質共役型受容体や核内受容体などのさまざまな受容体に直接作用したり、膜流動性調節や翻訳後修飾を介して間接的に作用したりすることにより、細胞内外のシグナル伝達に関与する強力なシグナル伝達分子であることが示唆されています6,7,8,9。.さらなる研究は、長寿と健康寿命を促進する脂質シグナル伝達の根底にある分子メカニズムを解明し続けます。
モデル生物は、人間で研究するには複雑すぎる特定の生物学的問題に対処するために重要です。たとえば、回虫 C.エレガンスは 、人間の栄養と病気に関連する生物学的プロセスを解剖するための遺伝子分析を行うための優れたモデルです10。ヒトの生理学、複雑な組織、行動パターン、および豊富な遺伝子操作ツールに関連する高度に保存された分子経路により、 C.エレガンスは 注目に値するモデル生物となっています11。たとえば、 C. elegans は、表現型特異的遺伝子を特定するための遺伝子スクリーニングの転送、およびRNA干渉 を介した ゲノム全体の逆遺伝子スクリーニングに優れています12。
実験室では、線虫は大腸菌の芝生を播種した寒天ペトリプレートで成長し、タンパク質、炭水化物、飽和および不飽和脂肪酸などの主要栄養素をエネルギー源およびビルディングブロックとして提供し、補因子やビタミン13などの微量栄養素を提供します。哺乳類と同様に、線虫はパルミチン酸とステアリン酸の両方(それぞれ飽和16炭素分子と18炭素分子)から脂肪酸分子を合成し、順次不飽和不飽和脂肪酸(MUFA)と多価不飽和脂肪酸(PUFA)に伸長します14,15,16,17,18。興味深いことに、C. elegansは、脂肪酸生合成、不飽和化、および伸長に関与する必要なすべての脂肪酸およびコア酵素のde novo合成が可能であり、長鎖PUFAの合成を容易にします19。他の動物種とは異なり、C.エレガンスは、独自のω-3デサチュラーゼ酵素を使用して、18炭素および20炭素のω-6脂肪酸をω-3脂肪酸に変換できます。さらに、ワームはオレイン酸からのリノール酸(LA)の形成を触媒するΔ12デサチュラーゼを持っています(OA、18:1)20,21。ほとんどの動物または植物は、Δ12およびω-3デサチュラーゼの両方を欠いているため、PUFAを得るためにω-6およびω-3の食事摂取に依存しているのに対し、C.エレガンスは食事性脂肪酸を必要としない22。機能的なデサチュラーゼ酵素を欠く単離された変異体は、生殖、成長、寿命、神経伝達などの異なる生物学的プロセスにおける特定の脂肪酸の機能を研究するために使用されています。特定の生物学的経路に対する個々の脂肪酸の影響は、遺伝的アプローチと食事補給の両方を使用して対処できます16,17,23。今日まで、脂質研究は、神経学的および発達的条件における脂質合成、分解、貯蔵、および分解に関与する遺伝子の特性評価に焦点を合わせてきました24。しかし、長寿調節における脂質の役割は明らかになり始めたばかりです。
長寿制御における脂質シグナル伝達
脂質は、異なる組織や細胞型で細胞シグナル伝達カスケードを活性化することにより、長寿調節に重要な役割を果たします。最近の研究では、脂質結合タンパク質を介した転写および細胞間コミュニケーションの調節または膜受容体の認識における脂質の積極的な役割が強調されています25。さらに、食事療法の脂質補給は、脂質代謝がC.エレガンスの寿命にどのように影響するかを分析するための優れたツールを提供します。異なるMUFAおよびPUFAは、転写因子を活性化することによって長寿を促進することが示されている26,27。
インスリン/IGF-1シグナル伝達や生殖細胞前駆細胞のアブレーションなどの長寿モデルは、MUFA生合成経路に関連しており、オレイン酸、パルミトレイン酸、シスバクセン酸などのMUFA補給は、C.エレガンスの寿命を延ばすのに十分です26。MUFA投与によってもたらされた長寿効果はさらなる調査が必要ですが、根底にあるメカニズムは、酸化ストレス応答と長寿調節の重要な活性化因子であるSKN-1 / Nrf2転写因子によって媒介される可能性があります28,29。MUFAの中で、N-アシルエタノールアミン(NAE)と呼ばれる特定のクラスの脂肪酸アシルエタノールアミドは、炎症、アレルギー、学習、記憶、エネルギー代謝などの明確なメカニズムにおいて重要な役割を果たします30。特に、オレオイルエタノールアミド(OEA)として知られる脂質分子は、脂質結合タンパク質8(LBP-8)の核への転座を促進して核ホルモン受容体NHR-49およびNHR-80を活性化することにより、長寿の正の調節因子として同定されている7。OEAアナログKDS-5104の補充は、寿命を延ばすのに十分であり、酸化ストレス応答およびミトコンドリアβ酸化に関与する遺伝子の発現を誘導する7,8。
同時に、PUFAの役割は長寿規制にも関連しています。PUFAのω-3脂肪酸α-リノレン酸(ALA)の投与は、NHR-49 / PPARα、SKN-1 / NRF転写因子を活性化し、ミトコンドリアβ酸化を誘導することにより、長寿を促進します31。興味深いことに、オキシリピンと呼ばれるALAの過酸化生成物はSKN-1 / NRFを活性化し、PUFAとその酸化的誘導体の両方が長寿の利点をもたらす可能性があることを示唆しています23。ω-6脂肪酸アラキドン酸(AA)およびジホモ-γ-リノレン酸(DGLA)の補給は、オートファジー活性化を介して寿命を延ばし、タンパク質品質管理を促進し、無駄で有毒なタンパク質凝集体の分解をもたらす27,32。最近では、脂質結合タンパク質3(LBP-3)とDGLAによって媒介される細胞非自律的なシグナル伝達調節が、末梢信号をニューロンに送ることによって長寿を促進するのに重要であることが示され、全身レベルでの組織間コミュニケーションにおける脂質分子の長期的な役割を示唆しています33。本研究では、プレートに播種した細菌または液体培養中の細菌懸濁液で脂質補給を行う各ステップを報告する。これらの方法論は、寿命と転写分析を評価するために使用され、全身の内容物またはいくつかのワームに由来する解剖組織を使用します。以下の技術は、さまざまな栄養研究に適応させることができ、脂質代謝が長寿と健康的な老化にどのように影響するかを分析するための有効なツールを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
脂質補給は、健康的な老化に対する特定の脂質種の直接的な影響を解明するための老化研究に採用されています6,7,23,26,27,31。ただし、脂質補給手順は困難な場合があり、実験間の不一致は再現性のない結果を引き起こす可能性があります。ここ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
メンテナンスサポートを提供してくださったP. Svayに感謝します。この研究は、NIH助成金R01AG045183(MCW)、R01AT009050(MCW)、R01AG062257(MCW)、DP1DK113644(MCW)、マーチオブダイムズ財団(MCW)、ウェルチ財団(MCW)、HHMI研究者(M.C.W.)、およびNIH T32 ES027801博士課程前学生フェロー(M.S.)によってサポートされました。一部の菌株は、NIH研究インフラストラクチャプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されているCGCによって提供されました。
Materials
| 1.5 mL Pestle | Genesee Scientific | 93-165P15 | For worm grinding with Trizol |
| Agarose | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | For reverse transcription from bulk worm samples |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | For qRT-PCR |
| Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1248 | For spin down PCR tubes |
| Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
| Eppendorf 5424 R centrifuge | Eppendorf | 22620444R | For RNA extraction |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | For reverse transcription |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate | Neta Scientific | 665180 | 12-well plates for licuid feeding |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | For worm6-cm NGM plates |
| Invitrogen nuclease-free water | ThermoFisher | AM9937 | |
| Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
| Levamisole hydrochloride | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| lipl-4Tg;fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| Luria Broth Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode | ThermoFisher | 4483354 | 96-well qPCR plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied BioSystem | 4311971 | For sealing the 96-well qPCR plate |
| Milli-Q Advantage A10 Water Purification System | Sigma | Z00Q0V0WW | Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol |
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | N/A | For measuring RNA concentration |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Bacteria used as C. elegans food |
| Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Power SYBR Green cells-to-Ct kit | ThermoFisher | 4402953 | For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue |
| Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | For qPCR from bulk worm samples |
| Pure Bright germicidal ultra bleach | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% house bleach For worm egg preparation |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | Watch glass for dissecting the worms |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | ThermoFisher | AM9780 | |
| Sodium cloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge | Thermo | 7500-4337 | For bacteria collection |
| Thermo Sorvall ST 8 centrifuge | Thermo | 7500-7200 | For worm egg preparation |
| TRIzol Reagent | TheroFisher | 15596018 | RNA extraction reagent |
| Turbo DNA-free kit | ThermoFisher | AM1907 | For removing DNA contamination in RNA extractions |
| Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor | VWR | 47747-370 | For worm grinding with Trizol |
| VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 | VWR | N/A | For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064 |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
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