Lipidtilskudd for lang levetid og gentranskripsjonsanalyse i Caenorhabditis elegans

Summary

Den nåværende protokollen beskriver lipidtilskuddsmetoder i flytende og on-plate kulturer for Caenorhabditis elegans, kombinert med longitudinelle studier og gentranskripsjonsanalyse fra bulk eller noen få ormer og ormvev.

Abstract

Aldring er en kompleks prosess preget av progressive fysiologiske endringer som følge av både miljømessige og genetiske bidrag. Lipider er avgjørende for å utgjøre strukturelle komponenter i cellemembraner, lagre energi og som signalmolekyler. Regulering av lipidmetabolisme og signalering er viktig for å aktivere forskjellige levetidsveier. Rundorm Caenorhabditis elegans er en utmerket og kraftig organisme for å dissekere bidraget av lipidmetabolisme og signalering i levetidsregulering. Flere forskningsstudier har beskrevet hvordan dietttilskudd av spesifikke lipidmolekyler kan forlenge C. elegans levetid; Imidlertid kan mindre forskjeller i tilskuddsbetingelsene forårsake reproduserbarhetsproblemer blant forskere i forskjellige laboratorier. Her rapporteres to detaljerte tilskuddsmetoder for C. elegans ved bruk av lipidtilskudd enten med bakterier frøet på plater eller bakteriell suspensjon i flytende kultur. Også gitt her er detaljene for å utføre levetidsanalyser med livslang lipidtilskudd og qRT-PCR-analyse ved hjelp av et helt ormlysat eller dissekert vev avledet fra noen få ormer. Ved hjelp av en kombinasjon av longitudinelle studier og transkripsjonsundersøkelser ved lipidtilskudd, gir fôringsanalysene pålitelige tilnærminger for å dissekere hvordan lipider påvirker levetid og sunn aldring. Denne metoden kan også tilpasses ulike ernæringsmessige screeningtilnærminger for å vurdere endringer i en delmengde av transkripsjoner ved hjelp av enten et lite antall dissekerte vev eller noen få dyr.

Introduction

Lipider
Lipider er små hydrofobe eller amfipatiske molekyler som er oppløselige i organiske løsningsmidler, men uoppløselige i vann ^1,2. Distinkte lipidmolekyler skiller seg fra hverandre basert på antall karboner inneholdt i deres kjeder, plassering, antall dobbeltbindinger og bundne strukturer, inkludert glyserol eller fosfater. Lipider spiller avgjørende roller i og på tvers av forskjellige celler for å regulere organismefunksjoner, inkludert konstituering av membran dobbeltlag, gir energilagring og fungerer som signalmolekyler ^3,4.

For det første er lipider strukturelle komponenter av biologiske membraner, inkludert plasmamembranen og intracellulære subcellulære membraner som deler de indre rommene fra det ekstracellulære miljøet. For det andre er lipider den viktigste formen for energilagring hos virveldyr og virvelløse dyr. Nøytrale lipider, inkludert triacylglyceroler, lagres i lengre tid i forskjellige vev, inkludert i fettvev. I nematoden Caenorhabditis elegans er tarmen det viktigste metabolske fettlagringsorganet; Dens funksjon er ikke bare involvert i fordøyelse og absorpsjon av næringsstoffer, men også i avgiftningsprosessen, som ligner aktiviteten til pattedyrs hepatocytter. Andre fettlagringsvev inkluderer kimlinjen, der lipider er essensielle for å utvikle oocytter, og hypodermis, som består av hudlignende epidermale celler ^3,5. For det tredje har flere bevis de siste årene antydet at lipider er kraftige signalmolekyler involvert i intra- og ekstracellulær signalering ved å virke direkte på en rekke reseptorer, inkludert G-proteinkoblede og nukleære reseptorer, eller indirekte via membranfluiditetsmodulasjon eller posttranslasjonelle modifikasjoner 6,7,8,9 . Videre studier vil fortsette å belyse de underliggende molekylære mekanismene for lipidsignalering for å fremme lang levetid og helsespan.

Modellorganismer er viktige for å løse spesifikke biologiske spørsmål som er for komplekse til å studere hos mennesker. For eksempel er rundorm C. elegans en utmerket modell for å gjennomføre genetisk analyse for å dissekere biologiske prosesser som er relevante for menneskelig ernæring og sykdom¹⁰. De svært konserverte molekylære veiene som er relevante for menneskelig fysiologi, komplekse vev, atferdsmønstre og rikelig genetiske manipulasjonsverktøy gjør C. elegans til en bemerkelsesverdig modellorganisme¹¹. For eksempel er C. elegans utmerket i å videresende genetiske skjermer for å identifisere fenotypespesifikke gener, så vel som i genom-brede omvendte genetiske skjermer via RNA-interferens¹².

I laboratorier dyrkes nematodene på agar petriplater frøet med en plen av Escherichia coli-bakterier, som gir makronæringsstoffer som proteiner, karbohydrater og mettede og umettede fettsyrer som energikilder og byggesteiner, og mikronæringsstoffer som kofaktorer og vitaminer¹³. I likhet med pattedyr syntetiserer nematoder fettsyremolekyler fra både palmitinsyre og stearinsyre (henholdsvis mettet 16-karbon og 18-karbonmolekyler) som er sekvensielt desaturert og langstrakt til en rekke mono-umettede fettsyrer (MUFA) og poly-umettede fettsyrer (PUFA) 14,15,16,17,18. Interessant nok er C. elegans i stand til de novo syntese av alle nødvendige fettsyrer og kjerneenzymer involvert i fettsyrebiosyntese, desaturasjon og forlengelse, noe som letter syntesen av langkjedede PUFA¹⁹. Forskjellig fra andre dyrearter, kan C. elegans konvertere 18-karbon og 20-karbon ω-6 fettsyrer til ω-3 fettsyrer med egne ω-3 desaturase enzymer. I tillegg har ormer en Δ12 desaturase som katalyserer dannelsen av linolsyre (LA) fra oljesyre (OA, 18: 1) ^20,21. De fleste dyr eller planter mangler både Δ12 og ω-3 desaturaser og er dermed avhengige av diettinntak på ω-6 og ω-3 for å få sine PUFAer, mens C. elegans ikke krever diettfettsyrer²². Isolerte mutanter som mangler funksjonelle desaturase enzymer har blitt brukt til å studere funksjonene til spesifikke fettsyrer i forskjellige biologiske prosesser, inkludert reproduksjon, vekst, lang levetid og nevrotransmisjon. Effekten av individuelle fettsyrer på spesifikke biologiske veier kan løses ved hjelp av både en genetisk tilnærming og dietttilskudd^16,17,23. Hittil har lipidforskning fokusert på å karakterisere gener involvert i lipidsyntese, nedbrytning, lagring og nedbrytning i nevrologiske og utviklingsmessige forhold²⁴. Imidlertid begynner lipidens roller i levetidsregulering bare å bli avslørt.

Lipidsignalering i levetidsregulering
Lipider spiller avgjørende roller i levetidsregulering ved å aktivere cellulære signalkaskader i forskjellige vev og celletyper. Nylige studier har fremhevet lipidens aktive roller i modulering av transkripsjon og cellecellekommunikasjon via lipidbindende proteiner eller anerkjennelse av membranreseptorer²⁵. I tillegg tilbyr kosttilskudd lipidtilskudd et utmerket verktøy for å dissekere hvordan lipidmetabolismen påvirker levetiden i C. elegans. Distinkte MUFAer og PUFAer har vist seg å fremme lang levetid ved å aktivere transkripsjonsfaktorer^26,27.

Levetidsmodeller, inkludert insulin / IGF-1-signalering og ablasjon av kimlinjeforløperceller, er assosiert med MUFA-biosynteseveien, og MUFA-tilskudd, inkludert oljesyre, palmitolsyre og cis-vaccenic, er tilstrekkelig til å forlenge C. elegans levetid²⁶. Selv om levetidseffekten gitt av MUFA-administrasjonen krever ytterligere undersøkelser, vil den underliggende mekanismen sannsynligvis bli formidlet av SKN-1/Nrf2-transkripsjonsfaktoren, som er en nøkkelaktivator for oksidativ stressrespons og levetidsregulering^28,29. Blant MUFA spiller en bestemt klasse av fete acyletanolamider kalt N-acyletanolaminer (NAE) avgjørende roller i forskjellige mekanismer, inkludert betennelse, allergier, læring, minne og energimetabolisme³⁰. Spesielt har lipidmolekylet kjent som oleoyletanolamid (OEA) blitt identifisert som en positiv regulator av lang levetid ved å fremme translokasjonen av det lipidbindende proteinet 8 (LBP-8) inn i kjernen for å aktivere nukleære hormonreseptorer NHR-49 og NHR-80⁷. Tilskudd av OEA-analogen KDS-5104 er tilstrekkelig til å forlenge levetiden, og induserer uttrykket av gener involvert i oksidative stressresponser og mitokondriell β-oksidasjon ^7,8.

Samtidig har PUFA-rollen også vært knyttet til levetidsregulering. Administrering av PUFA ω-3 fettsyre α-linolensyre (ALA) fremmer lang levetid ved å aktivere transkripsjonsfaktorene NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF og indusere mitokondriell β-oksidasjon³¹. Interessant nok aktiverer peroksiderte produkter av ALA, referert til som oksylipiner, SKN-1 / NRF, noe som tyder på at både PUFA og deres oksidative derivater kan gi levetidsfordeler²³. Tilskudd av ω-6 fettsyre arakidonsyre (AA) og dihomo-γ-linolensyre (DGLA) forlenger levetiden via autofagiaktivering, fremmer proteinkvalitetskontroll og resulterer i nedbrytning av bortkastede og giftige proteinaggregater^27,32. Mer nylig har en celle-ikke-autonom signalregulering mediert av lipidbindende protein 3 (LBP-3) og DGLA vist seg å være avgjørende for å fremme lang levetid ved å sende perifere signaler til nevroner, noe som tyder på en langdistanserolle av lipidmolekyler i kommunikasjon mellom vev på systemiske nivåer³³. Den foreliggende studien rapporterer hvert trinn for å utføre lipidtilskudd med bakterier frøet på plater eller bakteriell suspensjon i flytende kultur. Disse metodene brukes til å vurdere levetid og transkripsjonsanalyse, ved hjelp av helkroppsinnhold eller dissekert vev avledet fra noen få ormer. Følgende teknikker kan tilpasses en rekke ernæringsstudier og tilbyr et gyldig verktøy for å dissekere hvordan lipidmetabolismen påvirker lang levetid og sunn aldring.

Protocol

Figur 1 viser et skjema for lipidfôring ved hjelp av forskjellige eksperimentelle innstillinger. 1. Fremstilling av lipidbetingede bakterier Forbered bakteriell fortynning diettbegrensning (BDR) baseløsning ved å oppløse 5,85 g NaCl, 1,0 g K 2 HPO 4 og6,0 g KH2PO4 (se materialtabell) i 999 ml avionisert vann. Juster pH til 6,0 med 0,5 M KOH, og filtrer deretter gjennom et 0…

Representative Results

Validering av transkripsjonsendringer ved bruk av noen få hele ormer ved lipidtilskuddFor å undersøke om protokollen for å trekke ut og retrotranskribere RNA til cDNA fra noen få hele ormer er reproduserbar og sammenlignbar med dataene fra bulkormer, ble en langlivet ormstamme som overuttrykker lysosomalsyrelipase lipl-4 i tarmen ansatt 7,8,33,35. Transkripsjo…

Discussion

Lipidtilskudd har blitt brukt i aldringsforskning for å belyse den direkte effekten av visse lipidarter på sunn aldring ^{6,7,23,26,27,31}. Imidlertid kan lipidtilskuddsprosedyren være utfordrende, og enhver inkonsekvens mellom eksperimenter kan forårsake ikke-reproduserbare resultater. Her er den første detaljerte trinnvis…

Materials

1.5 mL Pestle	Genesee Scientific	93-165P15	For worm grinding with Trizol
Agarose	Sigma	A9639-500G
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix	GenDEPOT	R5600	For reverse transcription from bulk worm samples
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR	ThermoFisher	A28567	For qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge	Benchmark Scientific	C1248	For spin down PCR tubes
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip	Branson Ultrasonic Corporation	100-132-888R
Chloroform	Fisher Scientific	C298-500
Cholesterol	Sigma	C8503-25G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-100ML
Eppendorf 5424 R centrifuge	Eppendorf	22620444R	For RNA extraction
Eppendorf vapo protect mastercycler pro	Eppendorf	950030010	For reverse transcription
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate	Neta Scientific	665180	12-well plates for licuid feeding
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm	Neta Scientific	664161	For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm	Neta Scientific	628161	For worm6-cm NGM plates
Invitrogen nuclease-free water	ThermoFisher	AM9937
Isoproanol	Sigma	PX1835-2
Levamisole hydrochloride	VWR	SPCML1054
lipl-4Tg	MCW Lab	N/A	Transgenic C. elegans
lipl-4Tg;fat-3(wa22)	MCW Lab	N/A	Transgenic C. elegans
Luria Broth Base	ThermoFisher	12795-084
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma	M2643-500G
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode	ThermoFisher	4483354	96-well qPCR plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied BioSystem	4311971	For sealing the 96-well qPCR plate
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System	Sigma	Z00Q0V0WW	Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol
N2	Caenorhabditis Genetics Center	N/A	C. elegans wild isolate
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer	ThermoFisher	N/A	For measuring RNA concentration
OP50	Caenorhabditis Genetics Center	N/A	Bacteria used as C. elegans food
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O)	Sigma	P5504-1KG
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma	P0662-2.5KG
Power SYBR Green cells-to-Ct kit	ThermoFisher	4402953	For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue
Power SYBR Green Master Mix	ThermoFisher	4367659	For qPCR from bulk worm samples
Pure Bright germicidal ultra bleach	KIK International LLC.	59647210143	6% house bleach For worm egg preparation
Pyrex spot plate with nine depressions	Sigma	CLS722085-18EA	Watch glass for dissecting the worms
RNaseZap RNase Decontamination Solution	ThermoFisher	AM9780
Sodium cloride (NaCl)	Sigma	S7653-1KG
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	SX0590-3
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O)	Sigma	S9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge	Thermo	7500-4337	For bacteria collection
Thermo Sorvall ST 8 centrifuge	Thermo	7500-7200	For worm egg preparation
TRIzol Reagent	TheroFisher	15596018	RNA extraction reagent
Turbo DNA-free kit	ThermoFisher	AM1907	For removing DNA contamination in RNA extractions
Vortexer 59	Denville Scientific INV	S7030
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor	VWR	47747-370	For worm grinding with Trizol
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115	VWR	N/A	For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064
Worm picker	WormStuff	59-AWP