Липидные добавки для долголетия и транскрипционного анализа генов при caenorhabditis elegans
Summary
Настоящий протокол описывает методы добавления липидов в жидких и пластинчатых культурах для Caenorhabditis elegans в сочетании с продольными исследованиями и анализом транскрипции генов из объемных или нескольких червей и тканей червей.
Abstract
Старение является сложным процессом, характеризующимся прогрессирующими физиологическими изменениями, возникающими в результате как экологического, так и генетического вклада. Липиды имеют решающее значение для создания структурных компонентов клеточных мембран, хранения энергии и в качестве сигнальных молекул. Регуляция липидного обмена и передачи сигналов необходима для активации различных путей долголетия. Круглый червь Caenorhabditis elegans является отличным и мощным организмом для препарирования вклада липидного обмена и передачи сигналов в регуляцию долголетия. Многочисленные исследования описывали, как пищевые добавки специфических молекул липидов могут продлить продолжительность жизни C. elegans ; однако незначительные различия в условиях приема добавок могут вызвать проблемы воспроизводимости у ученых в разных лабораториях. Здесь сообщается о двух подробных методах добавок для C. elegans, использующих липидные добавки либо с бактериями, посеянными на пластинах, либо с бактериальной суспензией в жидкой культуре. Также в настоящем описании приведены сведения для выполнения анализов продолжительности жизни с пожизненным приемом липидных добавок и qRT-PCR-анализа с использованием целого лизата червя или рассеченных тканей, полученных от нескольких червей. Используя комбинацию продольных исследований и транскрипционных исследований при приеме липидных добавок, анализы кормления обеспечивают надежные подходы к анализу того, как липиды влияют на долголетие и здоровое старение. Эта методология также может быть адаптирована для различных подходов к скринингу питания для оценки изменений в подмножестве транскриптов с использованием либо небольшого количества рассеченных тканей, либо нескольких животных.
Introduction
Липидов
Липиды представляют собой небольшие гидрофобные или амфипатические молекулы, растворимые в органических растворителях, но нерастворимые в воде 1,2. Различные липидные молекулы дифференцируются друг от друга на основе количества атомов углерода, содержащихся в их цепях, расположения, количества двойных связей и связанных структур, включая глицерин или фосфаты. Липиды играют решающую роль внутри и между отдельными клетками для регулирования функций организма, включая создание мембранных бислоев, обеспечение накопления энергии и действие в качестве сигнальных молекул 3,4.
Во-первых, липиды являются структурными компонентами биологических мембран, включая плазматическую мембрану и внутриклеточные субклеточные мембраны, которые отделяют внутренние компартменты от внеклеточной среды. Во-вторых, липиды являются основной формой накопления энергии у позвоночных и беспозвоночных животных. Нейтральные липиды, в том числе триацилглицерины, хранятся в течение длительного периода в различных тканях, в том числе в жировой ткани. У нематоды Caenorhabditis elegans кишечник является основным метаболическим органом хранения жира; его функция заключается не только в переваривании и усвоении питательных веществ, но и в процессе детоксикации, что напоминает активность гепатоцитов млекопитающих. Другие жиросохраняющие ткани включают зародышевую линию, в которой липиды необходимы для развития ооцитов, и гиподерму, которая состоит из кожистых клеток эпидермиса 3,5. В-третьих, в последние годы появилось больше доказательств того, что липиды являются мощными сигнальными молекулами, участвующими во внутри- и внеклеточной сигнализации, непосредственно воздействуя на различные рецепторы, включая рецепторы, связанные с G-белком, и ядерные рецепторы, или косвенно через модуляцию текучести мембраны или посттрансляционные модификации 6,7,8,9 . Дальнейшие исследования будут продолжать выяснять основные молекулярные механизмы передачи липидных сигналов в целях содействия долголетию и здоровью.
Модельные организмы важны для решения конкретных биологических вопросов, которые слишком сложны для изучения на людях. Например, круглый червь C. elegans является отличной моделью для проведения генетического анализа для препарирования биологических процессов, имеющих отношение к питанию человека и болезням10. Высоко консервативные молекулярные пути, относящиеся к физиологии человека, сложным тканям, поведенческим паттернам и обильным инструментам генетических манипуляций делают C. elegans замечательным модельным организмом11. Например, C. elegans отлично справляется с передачей генетических скринингов для идентификации генов, специфичных для фенотипа, а также в геномных обратных генетических скринингах с помощью РНК-интерференции12.
В лабораториях нематоды выращивают на агаровых пластинах Петри, засеянных газоном бактерий Escherichia coli, обеспечивающих макроэлементы, такие как белки, углеводы, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты в качестве источников энергии и строительных блоков, а также микроэлементы, такие как кофакторы и витамины13. Подобно млекопитающим, нематоды синтезируют молекулы жирных кислот как из пальмитиновой кислоты, так и из стеариновой кислоты (насыщенные 16-углеродные и 18-углеродные молекулы соответственно), которые последовательно денасыщены и удлинены до различных мононенасыщенных жирных кислот (MUFA) и полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК)14,15,16,17,18. Интересно, что C. elegans способен de novo синтезировать все необходимые жирные кислоты и основные ферменты, участвующие в биосинтезе жирных кислот, десатурации и удлинении, облегчая синтез длинноцепочечных ПНЖК19. В отличие от других видов животных, C. elegans может превращать 18-углеродные и 20-углеродные ω-6 жирные кислоты в ω-3 жирные кислоты с помощью собственных ферментов ω-3 десатуразы. Кроме того, черви обладают Δ12 десатуразой, которая катализирует образование линолевой кислоты (LA) из олеиновой кислоты (OA, 18: 1) 20,21. Большинство животных или растений испытывают недостаток как Δ12, так и ω-3 десатураз и, таким образом, полагаются на диетическое потребление ω-6 и ω-3 для получения своих ПНЖК, тогда как C. elegans не требует диетических жирных кислот22. Изолированные мутанты, лишенные функциональных ферментов десатуразы, использовались для изучения функций конкретных жирных кислот в различных биологических процессах, включая размножение, рост, долголетие и нейротрансмиссию. Влияние отдельных жирных кислот на конкретные биологические пути может быть рассмотрено с использованием как генетического подхода, так и пищевых добавок 16,17,23. На сегодняшний день исследования липидов сосредоточены на характеристике генов, участвующих в синтезе, деградации, хранении и разрушении липидов в неврологических условиях и условиях развития24. Однако роль липидов в регуляции долголетия только начинает раскрываться.
Липидная сигнализация в регуляции долголетия
Липиды играют решающую роль в регуляции долголетия, активируя клеточные сигнальные каскады в различных тканях и типах клеток. Недавние исследования подчеркнули активную роль липидов в модуляции транскрипции и клеточно-клеточной коммуникации через липидсвязывающие белки или распознавание мембранных рецепторов25. Кроме того, диетические липидные добавки предлагают отличный инструмент для анализа того, как липидный обмен влияет на продолжительность жизни у C. elegans. Было показано, что различные МУФА и ПНЖК способствуют долголетию путем активации факторов транскрипции26,27.
Модели долголетия, включая передачу сигналов инсулина / ИФР-1 и абляцию клеток-предшественников зародышевой линии, связаны с путем биосинтеза MUFA, и добавки MUFA, включая олеиновую кислоту, пальмитолеиновую кислоту и цис-вацценовую кислоту, достаточны для продления продолжительности жизни C. elegans 26. Хотя эффект долголетия, предоставляемый введением MUFA, требует дальнейшего изучения, основной механизм, вероятно, будет опосредован фактором транскрипции SKN-1 / Nrf2, который является ключевым активатором реакции на окислительный стресс и регуляции долголетия28,29. Среди MUFAs определенный класс жирных ацилэтаноламидов, называемых N-ацилэтаноламинами (NAE), играет решающую роль в различных механизмах, включая воспаление, аллергию, обучение, память и энергетический метаболизм30. В частности, липидная молекула, известная как олеоилэтаноламид (OEA), была идентифицирована как положительный регулятор долголетия, способствуя транслокации липидсвязывающего белка 8 (LBP-8) в ядро для активации рецепторов ядерного гормона NHR-49 и NHR-807. Добавление аналога OEA KDS-5104 является достаточным для продления продолжительности жизни и индуцирует экспрессию генов, участвующих в реакциях окислительного стресса и митохондриальной β окислении 7,8.
В то же время роль ПНЖК также связана с регулированием продолжительности жизни. Введение ПНЖК ω-3 жирных кислот α-линоленовой кислоты (ALA) способствует долголетию путем активации факторов транскрипции NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF и индуцирования митохондриального β-окисления31. Интересно, что перекисные продукты ALA, называемые оксилипинами, активируют SKN-1 / NRF, предполагая, что как ПНЖК, так и их окислительные производные могут придавать преимущества долголетия23. Добавление ω-6 жирных кислот арахидоновой кислоты (АА) и дигомо-γ-линоленовой кислоты (DGLA) продлевает продолжительность жизни за счет активации аутофагии, способствуя контролю качества белка и приводя к деградации расточительных и токсичных белковых агрегатов27,32. Совсем недавно было показано, что клеточная неавтономная сигнальная регуляция, опосредованная липид-связывающим белком 3 (LBP-3) и DGLA, имеет решающее значение для содействия долголетию путем отправки периферических сигналов нейронам, предполагая долгосрочную роль липидных молекул в межткановой коммуникации на системных уровнях33. В настоящем исследовании сообщается о каждом шаге для выполнения липидных добавок с бактериями, посеянными на пластинах или бактериальной суспензией в жидкой культуре. Эти методологии используются для оценки продолжительности жизни и транскрипционного анализа, используя содержимое всего тела или рассеченные ткани, полученные от нескольких червей. Следующие методы могут быть адаптированы к различным исследованиям в области питания и предлагают действительный инструмент для анализа того, как липидный обмен влияет на долголетие и здоровое старение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Липидные добавки были использованы в исследованиях старения, чтобы прояснить прямое влияние некоторых видов липидов на здоровое старение 6,7,23,26,27,31. Тем не менее, процедура добав…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим. Свая за техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI investigator (M.C.W.) и NIH T32 ES027801 pre-doctoral student fellow (M.S.). Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440).
Materials
| 1.5 mL Pestle | Genesee Scientific | 93-165P15 | For worm grinding with Trizol |
| Agarose | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | For reverse transcription from bulk worm samples |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | For qRT-PCR |
| Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1248 | For spin down PCR tubes |
| Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
| Eppendorf 5424 R centrifuge | Eppendorf | 22620444R | For RNA extraction |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | For reverse transcription |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate | Neta Scientific | 665180 | 12-well plates for licuid feeding |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | For worm6-cm NGM plates |
| Invitrogen nuclease-free water | ThermoFisher | AM9937 | |
| Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
| Levamisole hydrochloride | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| lipl-4Tg;fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| Luria Broth Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode | ThermoFisher | 4483354 | 96-well qPCR plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied BioSystem | 4311971 | For sealing the 96-well qPCR plate |
| Milli-Q Advantage A10 Water Purification System | Sigma | Z00Q0V0WW | Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol |
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | N/A | For measuring RNA concentration |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Bacteria used as C. elegans food |
| Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Power SYBR Green cells-to-Ct kit | ThermoFisher | 4402953 | For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue |
| Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | For qPCR from bulk worm samples |
| Pure Bright germicidal ultra bleach | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% house bleach For worm egg preparation |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | Watch glass for dissecting the worms |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | ThermoFisher | AM9780 | |
| Sodium cloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge | Thermo | 7500-4337 | For bacteria collection |
| Thermo Sorvall ST 8 centrifuge | Thermo | 7500-7200 | For worm egg preparation |
| TRIzol Reagent | TheroFisher | 15596018 | RNA extraction reagent |
| Turbo DNA-free kit | ThermoFisher | AM1907 | For removing DNA contamination in RNA extractions |
| Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor | VWR | 47747-370 | For worm grinding with Trizol |
| VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 | VWR | N/A | For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064 |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
References
- Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
- Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures. Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).
- Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Developmental Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
- Kimura, T., Jennings, W., Epand, R. M. Roles of specific lipid species in the cell and their molecular mechanism. Progress in Lipid Research. 62, 75-92 (2016).
- Duffy, J., Mutlu, A. S., Wang, M. C., Olsen, A., Gill, M. Lipid Metabolism, Lipid Signalling and Longevity. Ageing: Lessons from C. elegans. Healthy Ageing and Longevity. , 307-329 (2017).
- Lesa, G. M., et al. Long chain poly-unsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. Journal of Cell Science. 116 (24), 4965-4975 (2003).
- Folick, A., et al. Lysosomal signaling molecules regulate longevity in Caenorhabditis elegans. Science. 347 (6217), 83-86 (2015).
- Ramachandran, P. V., et al. Lysosomal signaling promotes longevity by adjusting mitochondrial activity. Developmental Cell. 48 (5), 685-696 (2019).
- Byrne, E. F. X., et al. Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains. Nature. 535 (7613), 517-522 (2016).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A. Transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. 유전학. 200 (2), 387-407 (2015).
- Nigon, V. M., Félix, M. -. A. History of research on C. elegans and other free-living nematodes as model organisms. WormBook. , 1-84 (2017).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
- Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PloS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. 유전학. 176 (2), 865-875 (2007).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PloS Genetics. 2 (7), 108 (2006).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 poly-unsaturated fatty acids cause behavioral and developmental defects in Caenorhabditis elegans fat-3 mutants. 유전학. 163 (2), 581-589 (2003).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of poly-unsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (9), 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Browse, J. A. Palmitoyl-CoA-specific Δ9 fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 263-269 (2000).
- Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends in Endocrinology & Metabolism. 20 (2), 58-65 (2009).
- Peyou-Ndi, M. M., Watts, J. L., Browse, J. Identification and characterization of an animal Δ12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Biochemistry and Biophysics. 376 (2), 399-408 (2000).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal ω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (4), 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Isolation and characterization of a Δ5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Archives of Biochemistry and Biophysics. 362 (1), 175-182 (1999).
- Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (81), e50879 (2013).
- Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
- Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Current Opinion in Lipidology. 28 (5), 408-413 (2017).
- Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
- O’Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. ω-6 Poly-unsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes & Development. 27 (4), 429-440 (2013).
- Steinbaugh, M. J., et al. Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence. eLife. 4, 07836 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 88, 290-301 (2015).
- Ezzili, C., Otrubova, K., Boger, D. L. Fatty acid amide signaling molecules. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20 (20), 5959-5968 (2010).
- Qi, W., et al. The ω-3 fatty acid α-linolenic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan via NHR-49/PPARα and oxidation to oxylipins. Aging Cell. 16 (5), 1125-1135 (2017).
- Shemesh, N., Meshnik, L., Shpigel, N., Ben-Zvi, A. Dietary-induced signals that activate the gonadal longevity pathway during development regulate a proteostasis switch in Caenorhabditis elegans adulthood. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 254 (2017).
- Savini, M., et al. Lysosome lipid signalling from the periphery to neurons regulates longevity. Nature Cell Biology. 24 (6), 906-916 (2022).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Wang, M. C., O’Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322 (5903), 957-960 (2008).
- Jacob, T. C., Kaplan, J. M. The EGL-21 carboxypeptidase E facilitates acetylcholine release at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscience. 23 (6), 2122-2130 (2003).
- Kass, J., Jacob, T. C., Kim, P., Kaplan, J. M. The EGL-3 proprotein convertase regulates mechanosensory responses of Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9265-9272 (2001).
- Bael, S. V., et al. Mass spectrometric evidence for neuropeptide-amidating enzymes in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 293 (16), 6052-6063 (2018).
- Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
