Lipidtillskott för livslängd och gentranskriptionsanalys i Caenorhabditis elegans
Summary
Detta protokoll beskriver lipidtillskottsmetoder i flytande och på plattkulturer för Caenorhabditis elegans, i kombination med longitudinella studier och gentranskriptionsanalys från bulk eller några maskar och maskvävnader.
Abstract
Åldrande är en komplex process som kännetecknas av progressiva fysiologiska förändringar som härrör från både miljömässiga och genetiska bidrag. Lipider är avgörande för att utgöra strukturella komponenter i cellmembran, lagra energi och som signalmolekyler. Reglering av lipidmetabolism och signalering är avgörande för att aktivera distinkta livslängdsvägar. Rundmask Caenorhabditis elegans är en utmärkt och kraftfull organism för att dissekera bidraget från lipidmetabolism och signalering i livslängdsreglering. Flera forskningsstudier har beskrivit hur kosttillskott av specifika lipidmolekyler kan förlänga C. elegans livslängd; Emellertid, mindre skillnader i tillskott villkor kan orsaka reproducerbarhet frågor bland forskare i olika laboratorier. Här, två detaljerade tillskott metoder för C. elegans rapporteras med hjälp av lipidtillskott antingen med bakterier utsäde på plattor eller bakteriell suspension i flytande kultur. Här finns också detaljerna för att utföra livslängdsanalyser med livslång lipidtillskott och qRT-PCR-analys med hjälp av en hel masklysat eller dissekerade vävnader härrörande från några maskar. Med hjälp av en kombination av longitudinella studier och transkriptionella undersökningar vid lipidtillskott ger utfodringsanalyserna pålitliga metoder för att dissekera hur lipider påverkar livslängden och hälsosamt åldrande. Denna metod kan också anpassas för olika näringsscreeningsmetoder för att bedöma förändringar i en delmängd av transkript med hjälp av antingen ett litet antal dissekerade vävnader eller några djur.
Introduction
Lipider
Lipider är små hydrofoba eller amfipatiska molekyler lösliga i organiska lösningsmedel men olösliga i vatten 1,2. Distinkta lipidmolekyler skiljer sig från varandra baserat på antalet kol som finns i deras kedjor, plats, antal dubbelbindningar och bundna strukturer, inklusive glycerol eller fosfater. Lipider spelar avgörande roller inom och över distinkta celler för att reglera organismfunktioner, inklusive att utgöra membran dubbelskikt, tillhandahålla energilagring och fungera som signalmolekyler 3,4.
För det första är lipider strukturella komponenter i biologiska membran, inklusive plasmamembranet och intracellulära subcellulära membran som delar de inre facken från den extracellulära miljön. För det andra är lipider den viktigaste formen av energilagring hos ryggradsdjur och ryggradslösa djur. Neutrala lipider, inklusive triacylglyceroler, lagras under en längre period i olika vävnader, inklusive i fettvävnad. I nematoden Caenorhabditis elegans är tarmen det viktigaste metaboliska fettlagringsorganet; Dess funktion är inte bara involverad i matsmältning och absorption av näringsämnen, men också i avgiftningsprocessen, som liknar aktiviteten hos däggdjurs hepatocyter. Andra fettlagringsvävnader inkluderar bakterielinjen, där lipider är väsentliga för att utveckla oocyter, och hypodermis, som består av hudliknande epidermala celler 3,5. För det tredje har fler bevis under de senaste åren föreslagit att lipider är kraftfulla signalmolekyler som är involverade i intra- och extracellulär signalering genom att direkt verka på en mängd olika receptorer, inklusive G-proteinkopplade och nukleära receptorer, eller indirekt via membranfluiditetsmodulering eller post-translationella modifieringar 6,7,8,9 . Ytterligare studier kommer att fortsätta att belysa de underliggande molekylära mekanismerna för lipidsignalering för att främja livslängd och hälsospann.
Modellorganismer är viktiga för att ta itu med specifika biologiska frågor som är för komplexa för att studera hos människor. Till exempel är rundmask C. elegans en utmärkt modell för att genomföra genetisk analys för att dissekera biologiska processer som är relevanta för mänsklig näring och sjukdom10. De mycket bevarade molekylära vägarna som är relevanta för mänsklig fysiologi, komplexa vävnader, beteendemönster och rikliga genetiska manipulationsverktyg gör C. elegans till en anmärkningsvärd modellorganism11. Till exempel är C. elegans utmärkt när det gäller att vidarebefordra genetiska skärmar för att identifiera fenotypspecifika gener, liksom i genomomfattande omvända genetiska skärmar via RNA-interferens12.
I laboratorier odlas nematoderna på agar Petri-plattor sådda med en gräsmatta av Escherichia coli-bakterier, vilket ger makronäringsämnen som proteiner, kolhydrater och mättade och omättade fettsyror som energikällor och byggstenar och mikronäringsämnen som samfaktorer och vitaminer13. I likhet med däggdjur syntetiserar nematoder fettsyramolekyler från både palmitinsyra och stearinsyra (mättade 16-kol- respektive 18-kolmolekyler) som sekventiellt desatureras och förlängs till en mängd olika monoomättade fettsyror (MUFA) och fleromättade fettsyror (PUFA)14,15,16,17,18. Intressant nog kan C. elegans de novo-syntes av alla nödvändiga fettsyror och kärnenzymer som är involverade i fettsyrabiosyntes, desaturering och förlängning, vilket underlättar syntesen av långkedjiga PUFA19. Till skillnad från andra djurarter kan C. elegans omvandla 18-kol och 20-kol ω-6 fettsyror till ω-3 fettsyror med sina egna ω-3 desaturasenzymer. Dessutom har maskar ett Δ12-desaturas som katalyserar bildandet av linolsyra (LA) från oljesyra (OA, 18:1)20,21. De flesta djur eller växter saknar både Δ12- och ω-3-desaturaser och förlitar sig därför på kostintag av ω-6 och ω-3 för att få sina PUFA, medan C. elegans inte kräver dietfettsyror22. Isolerade mutanter som saknar funktionella desaturasenzymer har använts för att studera funktionerna hos specifika fettsyror i distinkta biologiska processer, inklusive reproduktion, tillväxt, livslängd och neurotransmission. Effekten av enskilda fettsyror på specifika biologiska vägar kan hanteras med hjälp av både ett genetiskt tillvägagångssätt och kosttillskott16,17,23. Hittills har lipidforskning fokuserat på att karakterisera gener som är involverade i lipidsyntesen, nedbrytningen, lagringen och nedbrytningen vid neurologiska och utvecklingsförhållanden24. Emellertid, lipidernas roller i livslängdsreglering börjar bara avslöjas.
Lipidsignalering vid reglering av livslängd
Lipider spelar avgörande roller i livslängdsreglering genom att aktivera cellulära signalkaskader i distinkta vävnader och celltyper. Nyligen genomförda studier har belyst lipidernas aktiva roller för att modulera transkription och cell-cellkommunikation via lipidbindande proteiner eller igenkänning av membranreceptorer25. Dessutom erbjuder kosttillskott av lipider ett utmärkt verktyg för att dissekera hur lipidmetabolism påverkar livslängden i C. elegans. Distinkta MUFA: er och PUFA har visat sig främja livslängd genom att aktivera transkriptionsfaktorer26,27.
Livslängdsmodeller, inklusive insulin / IGF-1-signalering och ablation av bakterieprekursorceller, är associerade med MUFA-biosyntesvägen, och MUFA-tillskott, inklusive oljesyra, palmitolsyra och cis-vaccensyra, är tillräcklig för att förlänga C. elegans livslängd26. Även om livslängdseffekten från MUFA-administrationen kräver ytterligare undersökning, kommer den underliggande mekanismen sannolikt att förmedlas av transkriptionsfaktorn SKN-1/Nrf2, som är en viktig aktivator för oxidativ stressrespons och livslängdsreglering28,29. Bland MUFA spelar en viss klass av fettacyletanolamider som kallas N-acyletanolaminer (NAE) avgörande roller i distinkta mekanismer inklusive inflammation, allergier, inlärning, minne och energimetabolism30. Särskilt har lipidmolekylen som kallas oleoyletanolamid (OEA) identifierats som en positiv regulator av livslängd genom att främja translokationen av det lipidbindande proteinet 8 (LBP-8) i kärnan för att aktivera kärnhormonreceptorerna NHR-49 och NHR-807. Tillskott av OEA-analogen KDS-5104 är tillräcklig för att förlänga livslängden och inducerar uttrycket av gener som är involverade i oxidativa stressreaktioner och mitokondriell β-oxidation 7,8.
Samtidigt har PUFA:s roll också kopplats till reglering av livslängd. Administrering av PUFA ω-3 fettsyra α-linolensyra (ALA) främjar livslängden genom att aktivera NHR-49 / PPARα, SKN-1 / NRF transkriptionsfaktorer och inducera mitokondriell β-oxidation31. Intressant nog aktiverar peroxiderade produkter av ALA, kallade oxylipiner, SKN-1 / NRF, vilket tyder på att både PUFA och deras oxidativa derivat kan ge livslängdsfördelar23. Tillskott av ω-6-fettsyra-arakidonsyra (AA) och dihomo-γ-linolensyra (DGLA) förlänger livslängden via autofagiaktivering, främjar proteinkvalitetskontroll och resulterar i nedbrytning av bortkastade och giftiga proteinaggregat27,32. På senare tid har en cell-icke-autonom signalreglering medierad av det lipidbindande proteinet 3 (LBP-3) och DGLA visat sig vara avgörande för att främja livslängd genom att skicka perifera signaler till neuroner, vilket tyder på en långväga roll för lipidmolekyler i kommunikation mellan vävnader på systemiska nivåer33. Den aktuella studien rapporterar varje steg för att utföra lipidtillskott med bakterier sådda på plattor eller bakteriell suspension i flytande kultur. Dessa metoder används för att bedöma livslängd och transkriptionell analys, med användning av hela kroppsinnehåll eller dissekerade vävnader härledda från några maskar. Följande tekniker kan anpassas till en mängd olika näringsstudier och erbjuder ett giltigt verktyg för att dissekera hur lipidmetabolism påverkar livslängd och hälsosamt åldrande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lipidtillskott har använts i åldrande forskning för att belysa den direkta effekten av vissa lipidarter på friska åldrande 6,7,23,26,27,31. Emellertid, lipid tillskott förfarande kan vara utmanande, och eventuella inkonsekvens mellan experiment kan orsaka icke-reproducerbara resultat. Här dokumenteras det första detal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar P. Svay för underhållsstöd. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI-utredare (M.C.W.) och NIH T32 ES027801 pre-doktorandstipendiat (MS). Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| 1.5 mL Pestle | Genesee Scientific | 93-165P15 | For worm grinding with Trizol |
| Agarose | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | For reverse transcription from bulk worm samples |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | For qRT-PCR |
| Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1248 | For spin down PCR tubes |
| Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
| Eppendorf 5424 R centrifuge | Eppendorf | 22620444R | For RNA extraction |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | For reverse transcription |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate | Neta Scientific | 665180 | 12-well plates for licuid feeding |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | For worm6-cm NGM plates |
| Invitrogen nuclease-free water | ThermoFisher | AM9937 | |
| Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
| Levamisole hydrochloride | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| lipl-4Tg;fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| Luria Broth Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode | ThermoFisher | 4483354 | 96-well qPCR plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied BioSystem | 4311971 | For sealing the 96-well qPCR plate |
| Milli-Q Advantage A10 Water Purification System | Sigma | Z00Q0V0WW | Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol |
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | N/A | For measuring RNA concentration |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Bacteria used as C. elegans food |
| Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Power SYBR Green cells-to-Ct kit | ThermoFisher | 4402953 | For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue |
| Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | For qPCR from bulk worm samples |
| Pure Bright germicidal ultra bleach | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% house bleach For worm egg preparation |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | Watch glass for dissecting the worms |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | ThermoFisher | AM9780 | |
| Sodium cloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge | Thermo | 7500-4337 | For bacteria collection |
| Thermo Sorvall ST 8 centrifuge | Thermo | 7500-7200 | For worm egg preparation |
| TRIzol Reagent | TheroFisher | 15596018 | RNA extraction reagent |
| Turbo DNA-free kit | ThermoFisher | AM1907 | For removing DNA contamination in RNA extractions |
| Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor | VWR | 47747-370 | For worm grinding with Trizol |
| VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 | VWR | N/A | For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064 |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
References
- Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
- Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures. Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).
- Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Developmental Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
- Kimura, T., Jennings, W., Epand, R. M. Roles of specific lipid species in the cell and their molecular mechanism. Progress in Lipid Research. 62, 75-92 (2016).
- Duffy, J., Mutlu, A. S., Wang, M. C., Olsen, A., Gill, M. Lipid Metabolism, Lipid Signalling and Longevity. Ageing: Lessons from C. elegans. Healthy Ageing and Longevity. , 307-329 (2017).
- Lesa, G. M., et al. Long chain poly-unsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. Journal of Cell Science. 116 (24), 4965-4975 (2003).
- Folick, A., et al. Lysosomal signaling molecules regulate longevity in Caenorhabditis elegans. Science. 347 (6217), 83-86 (2015).
- Ramachandran, P. V., et al. Lysosomal signaling promotes longevity by adjusting mitochondrial activity. Developmental Cell. 48 (5), 685-696 (2019).
- Byrne, E. F. X., et al. Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains. Nature. 535 (7613), 517-522 (2016).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A. Transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. 유전학. 200 (2), 387-407 (2015).
- Nigon, V. M., Félix, M. -. A. History of research on C. elegans and other free-living nematodes as model organisms. WormBook. , 1-84 (2017).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
- Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PloS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. 유전학. 176 (2), 865-875 (2007).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PloS Genetics. 2 (7), 108 (2006).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 poly-unsaturated fatty acids cause behavioral and developmental defects in Caenorhabditis elegans fat-3 mutants. 유전학. 163 (2), 581-589 (2003).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of poly-unsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (9), 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Browse, J. A. Palmitoyl-CoA-specific Δ9 fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 263-269 (2000).
- Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends in Endocrinology & Metabolism. 20 (2), 58-65 (2009).
- Peyou-Ndi, M. M., Watts, J. L., Browse, J. Identification and characterization of an animal Δ12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Biochemistry and Biophysics. 376 (2), 399-408 (2000).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal ω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (4), 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Isolation and characterization of a Δ5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Archives of Biochemistry and Biophysics. 362 (1), 175-182 (1999).
- Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (81), e50879 (2013).
- Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
- Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Current Opinion in Lipidology. 28 (5), 408-413 (2017).
- Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
- O’Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. ω-6 Poly-unsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes & Development. 27 (4), 429-440 (2013).
- Steinbaugh, M. J., et al. Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence. eLife. 4, 07836 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 88, 290-301 (2015).
- Ezzili, C., Otrubova, K., Boger, D. L. Fatty acid amide signaling molecules. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20 (20), 5959-5968 (2010).
- Qi, W., et al. The ω-3 fatty acid α-linolenic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan via NHR-49/PPARα and oxidation to oxylipins. Aging Cell. 16 (5), 1125-1135 (2017).
- Shemesh, N., Meshnik, L., Shpigel, N., Ben-Zvi, A. Dietary-induced signals that activate the gonadal longevity pathway during development regulate a proteostasis switch in Caenorhabditis elegans adulthood. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 254 (2017).
- Savini, M., et al. Lysosome lipid signalling from the periphery to neurons regulates longevity. Nature Cell Biology. 24 (6), 906-916 (2022).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Wang, M. C., O’Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322 (5903), 957-960 (2008).
- Jacob, T. C., Kaplan, J. M. The EGL-21 carboxypeptidase E facilitates acetylcholine release at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscience. 23 (6), 2122-2130 (2003).
- Kass, J., Jacob, T. C., Kim, P., Kaplan, J. M. The EGL-3 proprotein convertase regulates mechanosensory responses of Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9265-9272 (2001).
- Bael, S. V., et al. Mass spectrometric evidence for neuropeptide-amidating enzymes in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 293 (16), 6052-6063 (2018).
- Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
