Imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma que invaden el cerebro del pez cebra
Summary
Informamos una técnica que permite obtener imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma (GBM) que invaden el tejido cerebral de un vertebrado. El acoplamiento de la inyección ortotópica de células GBM marcadas con fluorescencia en un cerebro transparente de pez cebra con imágenes intravitales de alta resolución permite la medición de la dinámica del citoesqueleto durante la invasión del cáncer in situ .
Abstract
Con un tiempo medio de supervivencia sombrío en poblaciones reales, entre 6 y 15 meses, el glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral maligno más devastador. El fracaso del tratamiento se debe principalmente a la invasividad de las células GBM, lo que habla de la necesidad de una mejor comprensión de las propiedades móviles de GBM. Para investigar el mecanismo molecular que apoya la invasión de GBM, se requieren nuevos modelos fisiológicos que permitan la caracterización en profundidad de la dinámica de las proteínas durante la invasión. Estas observaciones allanarían el camino para el descubrimiento de nuevos objetivos para bloquear la infiltración tumoral y mejorar los resultados de los pacientes. Este documento informa cómo un xenoinjerto ortotópico de células GBM en el cerebro del pez cebra permite imágenes vivas intravitales subcelulares. Centrándonos en los microtúbulos (MT), describimos un procedimiento para el marcado de MT en células GBM, microinyección de células GBM en el cerebro transparente de larvas de pez cebra 3 días después de la fertilización (dpf), imágenes intravitales de MT en los xenoinjertos diseminadores, alteración de la dinámica de MT para evaluar su papel durante la invasión de GBM y análisis de los datos adquiridos.
Introduction
La motilidad celular es un proceso estereotipado que requiere el establecimiento del eje de polaridad y reordenamientos citoesqueléticos generadores de fuerza. La polimerización de actina y su asociación con la miosina son reconocidas como los principales contribuyentes a las fuerzas protrusivas y contráctiles requeridas para el movimiento celular1. Los microtúbulos son considerados los principales actores de la polarización celular y la persistencia direccional durante la migración2. En los últimos años, también se ha demostrado que los MT crean y estabilizan protuberancias para soportar fuerzas mecanocompresivas durante la invasión celular en 3D3. Más recientemente, las MT han estado directamente involucradas en la mecanotransducción en adherencias focales y migración mecanosensible4. La inestabilidad dinámica que caracteriza la dinámica final de MT-plus está hecha de fases repetidas de polimerización (crecimiento) y despolimerización (contracción), que están controladas por una plétora de proteínas de unión a microtúbulos y cascadas de señalización intracelular, como las gobernadas por RHO-GTPasas 5,6,7. El papel de la red MT en la migración e invasión celular ha hecho que la investigación de la dinámica MT sea un elemento clave para comprender mejor los mecanismos de localización de células inmunes, cicatrización de heridas e invasión de cáncer.
La capacidad de las células cancerosas para escapar del núcleo tumoral primario, diseminarse en los tejidos y generar tumores secundarios es un paso crítico para prevenir el éxito global en la guerra contra el cáncer declarada hace 50 años 8,9. Uno de los mayores obstáculos ha sido comprender cómo las células cancerosas invaden activamente el tejido. Los mecanismos clave de invasión se basan en los mismos principios que los que rigen la migración celular no tumoral10. Sin embargo, han surgido especificidades de migración de células cancerosas11, lo que desencadena la necesidad de una mejor caracterización de este tipo de migración. Específicamente, debido a que el microambiente tumoral aparece como un jugador clave en la progresión del cáncer12, observar y analizar la invasión de células cancerosas en un contexto fisiológico relevante es esencial para desentrañar los mecanismos de diseminación de las células cancerosas.
Las MT son fundamentales para la progresión del cáncer, para sostener tanto la proliferación como la invasión. El análisis preciso de la dinámica de MT in situ puede ayudar a identificar agentes modificadores de MT (MTA) en ambos procesos. La dinámica de MT varía drásticamente según un cambio en el entorno. In vitro, el tratamiento con agentes desestabilizadores MT como el nocodazol previene la formación de protrusión celular cuando las células están incrustadas en geles en 3D, mientras que tiene poco efecto sobre la migración celular 2D13,14. Aunque técnicamente desafiantes, los avances en imágenes intravitales permiten el análisis in vivo de la dinámica de MT durante la invasión de células cancerosas. Por ejemplo, la observación de MTs en células de fibrosarcoma xenoinjertadas por vía subcutánea en ratones reveló que los macrófagos asociados a tumores afectan la dinámica de MT en células tumorales15. Sin embargo, estos modelos de ratón implican procedimientos quirúrgicos extensos y siguen siendo insatisfactorios para los cánceres menos accesibles, como el tumor cerebral altamente invasivo, GBM.
A pesar de un sombrío tiempo de supervivencia promedio de 15 meses16, se sabe poco sobre el modo de diseminación del GBM dentro del parénquima cerebral o los elementos moleculares clave que sostienen la invasión de células GBM en el tejido cerebral. La mejoría en el modelo de xenoinjerto ortotópico (PDX) de ratón y el establecimiento de ventanas craneales ofrecieron nuevas perspectivas para los estudios de invasión de células GBM17,18. Sin embargo, debido a la calidad de imagen subóptima, este modelo ha permitido principalmente imágenes longitudinales de xenoinjertos superficiales y no se ha utilizado con éxito para estudiar imágenes subcelulares de proteínas del citoesqueleto hasta ahora. Además, a raíz de la orden judicial de las “3R” para reducir el uso de roedores y reemplazarlos con vertebrados inferiores, se han establecido modelos alternativos.
Aprovechando la inmunidad primitiva observada en larvas de pez cebra (Danio rerio), se desarrolló la inyección ortotópica de células GBM en el cerebro del pez 19,20,21. La inyección en las proximidades de los ventrículos en el mesencéfalo en desarrollo recapitula la mayor parte de la fisiopatología humana del GBM21, yse observa el mismo patrón preferido de invasión del GBM que en los seres humanos, la cooptación de los vasos22. Gracias a la transparencia de las larvas de peces, este modelo permite la visualización de las células GBM que invaden el cerebro desde las áreas periventriculares donde se cree que surgen la mayoría de los GBM23.
Debido a que las MT son esenciales para la invasión celular de GBM in vitro24,25, se necesita una mejor caracterización de la dinámica de MT y la identificación de reguladores clave durante la invasión celular. Sin embargo, hasta la fecha, los datos generados con el modelo ortotópico de pez cebra no han incluido el análisis subcelular de la dinámica de MT durante el proceso de invasión. Este documento proporciona un protocolo para estudiar la dinámica de MT in vivo y determinar su papel durante la invasión del cáncer cerebral. Después del etiquetado estable de microtúbulos, las células GBM se microinyectan a 3 dpf en los cerebros de las larvas de pez cebra y se obtienen imágenes en tiempo real a alta resolución espacio-temporal durante su progresión en el tejido cerebral. Las imágenes en vivo de MT fluorescentes permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la dinámica de MT plus-end. Además, este modelo permite evaluar el efecto de los MTA en la dinámica de MT y en las propiedades invasivas de las células GBM en tiempo real. Este protocolo relativamente no invasivo combinado con un gran número de larvas manejadas a la vez y la facilidad de aplicación de fármacos (en el agua de los peces) hace que el modelo sea un activo para las pruebas preclínicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es probable que la obtención de imágenes de xenoinjertos tumorales a resolución unicelular se convierta en una herramienta indispensable para mejorar nuestra comprensión de la biología del GBM. Las imágenes en vivo en modelos PDX de ratón han llevado a valiosos descubrimientos sobre cómo GBM invade colectivamente el tejido cerebral18. Sin embargo, hasta la fecha, la resolución espaciotemporal no es lo suficientemente alta como para revelar la dinámica de las proteínas que controlan la i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos al Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Francia) y su laboratorio, especialmente Valérie Briolat, y Emma Colucci-Guyon por proporcionarnos las líneas de pez cebra y el molde de plástico para placas de microinyección, y por su valiosa experiencia en procedimientos experimentales de pez cebra. Agradecemos a UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, apoyado por la Agencia Nacional de Investigación de Francia BioImaging, y ANR-10-INBS-04; Inversiones para el futuro). Este trabajo fue apoyado por la Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), el Centre National de la Recherche Scientifique y el Institut Pasteur y por las generosas donaciones de la Sra. Marguerite MICHEL y el Sr. Porquet.
Materials
| Glioblastoma cell culture | |||
| Foetal calf serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagent |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagent |
| Modified Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagent |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
| Lenitivirus production | |||
| BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
| BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
| HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagent |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagent |
| Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
| Cell passaging and staining | |||
| dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemical |
| Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
| Zebrafish husbandry | |||
| Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
| Methylene Blue hydrate | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemical |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Chemical |
| Transfer Pipettes fine tips | Samco Scientific | 232 | Equipment |
| Transfer Pipettes Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Equipment |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
| Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | Reagent |
| Xenotransplantation | |||
| 24-well plate | TPP | 92024 | Equipment |
| Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatus | (#30-0017 GC100-15 | Equipment |
| CellTram oil vario microinjector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
| Microloading pipet tips (Microloader) 20µL | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
| Micromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
| Stereomicroscope | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
| Universal capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
| Vertical Pipette puller | KOPF (Roucaire) | Model 720 | Instrument |
| Intravital Imaging | |||
| 3.5cm glass-bottom videoimaging dish | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Equipment |
| Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 | Nikon | Software | |
| Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
| Microscope head Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
| sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
| sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
| Ultrapure Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
| Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit | Hammatsu | Instrument | |
| Drug Treatment | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
| Image Analysis | |||
| Imaris 9.5.1 software | Oxford Instruments | Software | |
| ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |
References
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