Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Durchführung von Magnetresonanztomographie, Clearing und Immunmarkierung intakter Mausgehirne mit iDISCO+, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Bildgebung mittels Lichtblattmikroskopie und nachgeschalteten Analysen mit NuMorph.
Die Gewebereinigung gefolgt von Lichtblattmikroskopie (LSFM) ermöglicht die zelluläre Bildgebung intakter Gehirnstrukturen und ermöglicht eine quantitative Analyse struktureller Veränderungen, die durch genetische oder Umweltstörungen verursacht werden. Die Ganzhirnbildgebung führt zu einer genaueren Quantifizierung von Zellen und zur Untersuchung regionsspezifischer Unterschiede, die bei häufig verwendeter Mikroskopie von physisch geschnittenem Gewebe übersehen werden können. Die Verwendung von Lichtblattmikroskopie zur Abbildung geklärter Gehirne erhöht die Aufnahmegeschwindigkeit im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie erheblich. Obwohl diese Bilder sehr große Mengen an Gehirnstrukturdaten produzieren, sind die meisten Computerwerkzeuge, die eine Merkmalsquantifizierung in Bildern von geklärtem Gewebe durchführen, darauf beschränkt, spärliche Zellpopulationen und nicht alle Kerne zu zählen.
Hier demonstrieren wir NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), eine Gruppe von Analysewerkzeugen, um alle Kerne und Kernmarker in annotierten Regionen eines postnatalen Day 4 (P4) Mausgehirns nach der Klärung und Bildgebung auf einem Lichtblattmikroskop zu quantifizieren. Wir beschreiben Magnetresonanztomographie (MRT) zur Messung des Gehirnvolumens vor der Schrumpfung durch Dehydratationsschritte zur Gewebereinigung, Gewebereinigung mit der iDISCO+-Methode, einschließlich Immunmarkierung, gefolgt von Lichtblattmikroskopie mit einer kommerziell erhältlichen Plattform zur Abbildung von Mäusegehirnen mit zellulärer Auflösung. Anschließend demonstrieren wir diese Bildanalyse-Pipeline mit NuMorph, die verwendet wird, um Intensitätsunterschiede zu korrigieren, Bildkacheln zu nähen, mehrere Kanäle auszurichten, Kerne zu zählen und Gehirnregionen durch Registrierung in öffentlich verfügbaren Atlanten zu kommentieren.
Wir haben diesen Ansatz unter Verwendung öffentlich verfügbarer Protokolle und Software entwickelt, so dass jeder Forscher mit den erforderlichen Mikroskop- und Rechenressourcen diese Techniken durchführen kann. Diese Gewebereinigungs-, Bildgebungs- und Computerwerkzeuge ermöglichen die Messung und Quantifizierung der dreidimensionalen (3D) Organisation von Zelltypen im Kortex und sollten für jedes Wildtyp- / Knockout-Mausstudiendesign allgemein anwendbar sein.
Die Bildgebung des gesamten Gehirns mit Einzelzellauflösung ist eine wichtige Herausforderung in den Neurowissenschaften. Gehirnbilder mit zellularer Auflösung ermöglichen eine detaillierte Analyse und Kartierung von Gehirnschaltkreisen auf Systemebene und wie diese Schaltkreise durch genetische oder umweltbedingte Risikofaktoren für neuropsychiatrische Störungen, zelluläres Verhalten bei sich entwickelnden Embryonen sowie neuronale Schaltkreise im erwachsenen Gehirn gestört werden 1,2,3. Es gibt mehrere histologische Methoden, die hochauflösende Bilder des rekonstruierten 3D-Gehirns ermöglichen. Diese Techniken erfordern jedoch teure, spezialisierte Geräte, sind möglicherweise nicht mit der Immunmarkierung kompatibel, und die zweidimensionale (2D) Natur einiger Methoden kann zu Gewebeschäden und Scherung während des Schneidensführen 4,5.
Jüngste Fortschritte haben einen alternativen Ansatz für die Abbildung ganzer Gehirne ermöglicht, der keine Gewebeschnitte erfordert. Sie beinhalten die Verwendung von Gewebereinigung, um Gehirne transparent zu machen. Transparenz wird bei den meisten Gewebereinigungsmethoden erreicht, indem sowohl Lipide entfernt werden, da sie eine Hauptquelle der Lichtstreuung sind, als auch der Brechungsindex (RI) des Objekts mit dem RI der Probenimmersionslösung während der Bildgebung abgeglichen wird. Licht kann dann die Grenze zwischen Materialien passieren,ohne 6,7,8,9 gestreut zu werden.
Gewebereinigungsmethoden wie iDISCO+ werden häufig mit schneller 3D-Bildgebung mittels Einzelphotonen-Anregungsmikroskopie wie LSFM 6,7,10 kombiniert. In transparenten Geweben, die mit einem Fluorophor markiert sind, bildet die Lichtblattfluoreszenzmikroskopie Schnitte durch Anregung mit einer dünnen Lichtebene11. Der Hauptvorteil von LSFM besteht darin, dass jeweils ein einzelner optischer Schnitt beleuchtet wird, wobei die gesamte Fluoreszenz der Moleküle in diesem Abschnitt angeregt wird, wodurch das Photobleichen minimiert wird. Darüber hinaus ermöglicht die Abbildung einer gesamten optischen Scheibe eine kamerabasierte Erkennung dieser angeregten Scheibe und erhöht die Geschwindigkeit relativ zum Punktscannen12. LSFM erzeugt zerstörungsfrei gut registrierte optische Schnitte, die für die 3D-Rekonstruktion geeignet sind.
Während die iDISCO+-Methode eine kostengünstige Gewebereinigung innerhalb von ~3 Wochen ermöglicht, können Dehydratisierungsschritte innerhalb des Protokolls zu einer Schrumpfung des Gewebes und einer möglichen Veränderung der Probenmorphologie führen, wodurch volumetrische Messungen beeinträchtigtwerden 6,10. Durch Hinzufügen einer sekundären bildgebenden Methode wie MRT, die vor dem Gewebereinigungsverfahren verwendet wird, kann der Grad der durch die Gewebereinigung induzierten Schrumpfung in der gesamten Probe gemessen werden. Während der Dehydratisierungsschritte können Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften zwischen grauer und weißer Substanz zu ungleichmäßigen Verformungen der Hirnsubstanz führen, was zu unterschiedlichen Gewebereinigungs-induzierten Volumendeformationen zwischen Wildtyp- und mutierten Proben führt und Interpretationen volumetrischer Unterschiede in diesen Proben verwirren kann10,13 . Die MRT wird durchgeführt, indem das Tier zuerst mit einem Kontrastmittel (z. B. Gadolinium) perfundiert wird, gefolgt von der Inkubation des extrahierten Gewebes von Interesse in einer Tauchlösung (z. B. Fomblin) vor der Bildgebung14. Die MRT ist kompatibel mit der Gewebereinigung und der Durchführung von LSFM an derselben Probe.
LSFM wird häufig verwendet, um großflächige Mikroskopiebilder zur qualitativen Visualisierung des interessierenden Hirngewebes zu erstellen, anstatt die Gehirnstruktur quantitativ zu bewerten (Abbildung 1). Ohne quantitative Bewertung ist es schwierig, strukturelle Unterschiede nachzuweisen, die auf genetische oder umweltbedingte Beleidigungen zurückzuführen sind. Da sich die Gewebereinigungs- und Bildgebungstechnologien verbessern und die Kosten für Speicher und Rechenleistung sinken, wird die Quantifizierung von Zelltyplokalisationen innerhalb des interessierenden Gewebes zugänglicher, so dass mehr Forscher diese Daten in ihre Studien einbeziehen können.
Mit über 100 Millionen Zellen im Gehirn der Maus15 und bildgebenden Sitzungen des gesamten Gehirns, die Terabytes an Daten generieren können, besteht eine erhöhte Nachfrage nach fortschrittlichen Bildanalysewerkzeugen, die eine genaue Quantifizierung von Merkmalen in den Bildern, wie z. B. Zellen, ermöglichen. Es gibt eine Vielzahl von Segmentierungsmethoden für gewebebereinigte Bilder, die Schwellenwerte für die Intensität der Kernfärbung anwenden und Objekte mit vordefinierten Formen, Größen oder Dichten filtern10,16,17,18. Ungenaue Interpretationen der Ergebnisse können jedoch durch Variationen von Parametern wie Zellgröße, Bildkontrast und Beschriftungsintensität entstehen. Dieser Artikel beschreibt unser etabliertes Protokoll zur Quantifizierung von Zellkernen im Gehirn der Maus. Zuerst beschreiben wir die Schritte zur Gewebeentnahme des P4-Mausgehirns, gefolgt von einem Gewebereinigungs- und Immunmarkierungsprotokoll, das von der öffentlich verfügbaren iDISCO+-Methode10 optimiert wurde. Zweitens beschreiben wir die Bildaufnahme mittels MRT und Lichtblattmikroskopie, einschließlich der Parameter, die für die Aufnahme von Bildern verwendet werden. Schließlich beschreiben und demonstrieren wir NuMorph19, eine Reihe von Bildanalysewerkzeugen, die unsere Gruppe entwickelt hat und die zelltypspezifische Quantifizierung nach Gewebeklärung, Immunmarkierung mit Kernmarkern und Lichtblattbildgebung von annotierten Regionen ermöglicht.
Gewebereinigungsmethoden sind nützliche Techniken zur Messung der 3D-Zellorganisation des Gehirns. Es gibt eine Vielzahl von Gewebereinigungsmethoden, die in der Literatur beschrieben sind, jede mit ihren Vorteilen und Einschränkungen 6,7,8,9. Die Möglichkeiten für Computerwerkzeuge zur Analyse der Zelltypen in den gewebebereinigten Bildern sind relativ begrenzt. Andere verfügbare Werkzeug…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom NIH (R01MH121433, R01MH118349 und R01MH120125 an JLS und R01NS110791 an GW) und der Foundation of Hope unterstützt. Wir danken Pablo Ariel vom Microscopy Services Laboratory für die Unterstützung bei der Probenbildgebung. Das Microscopy Services Laboratory in der Abteilung für Pathologie und Labormedizin wird teilweise durch den Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 an das Lineberger Comprehensive Cancer Center der University of North Carolina (UNC) unterstützt. Der Neuroscience Microscopy Core wird durch den Zuschuss P30 NS045892 unterstützt. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde teilweise durch den North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016 unterstützt.
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
EVO 860 4TB external SSD | |||
Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
ITK Snap | segmentation software | ||
Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
Antibody | Working concentration | ||
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |