न्यूक्लियस मेकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए 3 डी चुंबकीय बल एक्ट्यूएटर और मल्टी-फंक्शनल फ्लोरेसेंस इमेजिंग का संयोजन
Summary
यह अध्ययन साइटोप्लाज्म में वितरित चुंबकीय माइक्रोबीड्स के माध्यम से सेल नाभिक पर यांत्रिक बल को सीधे लागू करने और एक साथ लाइव-सेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग का संचालन करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।
Abstract
मेकेनोबायोलॉजी में एक मौलिक सवाल यह है कि जीवित कोशिकाएं सेल फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी के संदर्भ में बाह्य यांत्रिक उत्तेजनाओं को कैसे समझती हैं। माना जाता है कि बाह्य यांत्रिक उत्तेजनाओं की सेलुलर मेकेनो-संवेदना झिल्ली रिसेप्टर्स, संबंधित प्रोटीन कॉम्प्लेक्स और साइटोस्केलेटन के माध्यम से होती है। मेकेनोबायोलॉजी में हालिया प्रगति से पता चलता है कि साइटोप्लाज्म में कोशिका नाभिक स्वतंत्र रूप से एक साथ यांत्रिक उत्तेजनाओं को समझ सकता है। हालांकि, सेल न्यूक्लियस यांत्रिक उत्तेजनाओं को कैसे समझता है, ट्रांसड्यूस करता है और प्रतिक्रिया करता है, इसकी एक यांत्रिक समझ की कमी है, मुख्य रूप से पारंपरिक उपकरणों द्वारा नाभिक यांत्रिकी तक पहुंचने और मात्रा निर्धारित करने में तकनीकी चुनौतियों के कारण। यह पेपर एक नए चुंबकीय बल एक्ट्यूएटर के डिजाइन, निर्माण और कार्यान्वयन का वर्णन करता है जो सेल नाभिक को सीधे विकृत करने के लिए सटीक और गैर-इनवेसिव 3 डी यांत्रिक उत्तेजनाओं को लागू करता है। CRISPR / Cas9-इंजीनियर कोशिकाओं का उपयोग करते हुए, यह अध्ययन दर्शाता है कि यह उपकरण, उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ मिलकर, नाभिक विरूपण के कार्य के रूप में एकल कोशिकाओं में एक मेकेनो-संवेदनशील हां-संबद्ध प्रोटीन (वाईएपी) की वास्तविक समय की गतिशीलता के रहस्योद्घाटन को सक्षम बनाता है। इस सरल विधि में मेकेनोबायोलॉजी समुदाय में वर्तमान प्रौद्योगिकी अंतर को पाटने और न्यूक्लियस मेकेनोट्रांसडक्शन और सेल फ़ंक्शन के बीच संबंध में मौजूद ज्ञान अंतर के उत्तर प्रदान करने की क्षमता है।
Introduction
इस अध्ययन का उद्देश्य चुंबकीय एक्ट्यूएटर के संयोजन से न्यूक्लियस मेकेनोबायोलॉजी को स्पष्ट करने के लिए एक नई तकनीक विकसित और लागू करना है जो सीधे सेल न्यूक्लियस पर यांत्रिक बल लागू करते हैं और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी जो एक साथ संरचनात्मक और कार्यात्मक उपकोशिकीय परिवर्तनों को चित्रित करते हैं। कोशिकाएं ऊतक कठोरता 1,2,3,4, अंतरालीय द्रव दबाव और कतरनी तनाव 5,6,7, सतह टोपोलॉजी / ज्यामिति 8,9,10,11,12, और तनाव / संपीड़न तनाव 13,14 सहित बाह्य बायोफिज़िकल संकेतों को महसूस करती हैं। 15,16. बायोफिज़िकल संकेतों को जैव रासायनिक संकेतों में परिवर्तित किया जाता है और जीन अभिव्यक्ति और कोशिका व्यवहार के संभावित डाउनस्ट्रीम परिवर्तनों को ट्रिगर किया जाता है- एक प्रक्रिया जिसे मेकेनोट्रांसडक्शन 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 के रूप में जाना जाता है . मेकैनोट्रांसडक्शन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं पर यांत्रिक बल को लागू करने के लिए असंख्य तकनीकों को विकसित किया गया है, जैसे परमाणु बल माइक्रोस्कोपी28, सेल स्ट्रेचिंग डिवाइस29, बायो-एमईएमएस (माइक्रो-इलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम) बल सेंसर 15,30,31, कतरनी रिओलॉजी 32, और स्टीरियो विजन सिस्टम33 . एक हालिया समीक्षा बाह्य यांत्रिक संकेतों को लागू करने और मेकेनोसेंसिंग34 के साथ हस्तक्षेप करने के दृष्टिकोण को सारांशित करती है। आज तक, इनमें से अधिकांश विधियां कोशिका प्लाज्मा झिल्ली पर बल लागू करती हैं, और कोशिकाएं सीधे इंटीग्रिन, कैडरिन, आयन चैनल और जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स जैसे झिल्ली रिसेप्टर्स के माध्यम से इन बाह्य बायोफिज़िकल संकेतों को प्राप्त करती हैं। इसके बाद, वे इंट्रासेल्युलर साइटोस्केलेटन और नाभिक को संकेत प्रेषित करते हैं। उदाहरण के लिए, मेकानो-सेंसिंग के संकेतक के रूप में हां से जुड़े प्रोटीन (वाईएपी) स्थानांतरण का उपयोग करते हुए, कोशिकाओं को कोशिका झिल्ली से सब्सट्रेट कठोरता और बाह्य तनाव के यांत्रिक संकेतों को समझने के लिए दिखाया जाता है और उन्हें वाईएपी साइटोप्लाज्म-टू-न्यूक्लियस ट्रांसलोकेशन 28,35 को प्रेरित करने के लिए साइटोस्केलेटन के माध्यम से नाभिक में संचारित किया जाता है।
हाल के सबूत बताते हैं कि सेल न्यूक्लियस स्वयं एक स्वतंत्र मेचानो-सेंसर 8,36,37 है। यह कोशिकाओं से काटे गए पृथक नाभिक पर किए गए प्रयोगों से साबित होता है, जहां यह पता चला था कि नाभिक सीधे उन पर लागू यांत्रिक बल के जवाब में अपनी कठोरता को अनुकूली रूप से बदलतेहैं। कई शारीरिक स्थितियों के दौरान, ट्यूमर और स्वस्थ कोशिकाओं दोनों में नाभिक बाह्य बायोफिज़िकल संकेतों को महसूस करते हैं और अपने यांत्रिक गुणों और असेंबलीको 38,39,40 बदलते हैं। उदाहरण के लिए, अतिरिक्तता पर, ट्यूमर कोशिकाओं की परमाणु कठोरता कम हो जाती है और 24 घंटे38 से अधिक समय तक कोमलता बनाए रखती है। सीमित अंतरालीय स्थान के माध्यम से प्रवास के दौरान, ट्यूमर कोशिकाओं के नाभिक अक्सर अपनी संरचनात्मक अखंडता को खो देते हैं और पुनर्प्राप्त करतेहैं। हालांकि, जिस तरह से नाभिक बायोफिज़िकल सिग्नल को महसूस करता है वह अज्ञात है, हालांकि कई परमाणु-लिफाफा प्रोटीन और प्रोटीन के परिवार शामिल पाए गए हैं, जैसे कि लैमिन ए / सी और न्यूक्लियोस्केलेटन और साइटोस्केलेटन (एलआईएनसी) कॉम्प्लेक्स38,41 के लिंकर। इसलिए, नए गैर-इनवेसिव तरीके जो सीधे नाभिक पर बल लागू कर सकते हैं, कोशिका-प्लाज्मा झिल्ली और साइटोस्केलेटन से बल संचरण के प्रभाव को कम करेंगे, और परमाणु मेकानो-सेंसिंग के पहले दुर्गम आणविक तंत्र को स्पष्ट करने में मदद करेंगे।
ऑर्गेनेल42 और माइक्रोबीड्स को कोशिकाओं43 में इंजेक्ट करने के लिए ऑप्टिकल ट्वीज़र्स को नियोजित करने वाले शोध ने नाभिक पर सीधे बल लागू करने की तकनीकी क्षमता दिखाई। हालांकि, ऑप्टिकल-ट्वीजर तकनीक की कई सीमाएं हैं: (1) कम थ्रूपुट-ऑप्टिकल ट्वीज़र अक्सर एक समय में केवल एक सेल या माइक्रोबीड में हेरफेर करते हैं; और (2) परमाणु के संभावित फोटोडैमेज और तापमान विरूपण-विरूपण के लिए दसियों पीएन36 की आवश्यकता होती है, और संबंधित आवश्यक लेजर शक्ति लगभग 10 एमडब्ल्यू प्रति पीएन 44,45 है। इस तरह की लेजर तीव्रता कोशिकाओं में फोटोडैमेज को ट्रिगर करने और प्रयोग के दौरान सेल कार्यों को परेशान करने के लिए पर्याप्तहै।
जीवित कोशिकाओं के भीतर माइक्रोबीड्स के माध्यम से लागू चुंबकीय बल नाभिक पर सीधे बल लागू करने की क्षमता दिखाता है और ऑप्टिकल चिमटी की सीमाओं को दूर करता है। एक बार माइक्रोबीड्स साइटोप्लाज्म में वितरित किए जाने के बाद, एक चुंबकीय क्षेत्र एक उच्च-थ्रूपुट तरीके से एक साथ कई माइक्रोबीड्स पर चुंबकीय बल डाल सकता है। चुंबकीय क्षेत्र सेल फ़ंक्शन47 को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन पीएन से एनएन तक बल उत्पन्न करता है, जो परमाणु विरूपण 36,48,49 को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। आज तक, चुंबकीय माइक्रोबीड्स का हेरफेर सेल प्लाज्मा झिल्ली48 पर, साइटोप्लाज्म50 के अंदर, एफ-एक्टिन51 पर, नाभिक47 के अंदर और पृथक नाभिक36 पर लागू किया गया है। हालांकि, नाभिक में मेकेनोट्रांसडक्शन का अध्ययन करने के लिए परमाणु लिफाफे पर प्रत्यक्ष यांत्रिक बल लागू करने के लिए माइक्रोबीड्स के चुंबकीय हेरफेर का उपयोग कभी नहीं किया गया है।
इस पेपर में, साइटोप्लाज्म में चुंबकीय माइक्रोबीड्स को गैर-आक्रामक रूप से वितरित करने और नाभिक पर यांत्रिक बल लागू करने के लिए इन माइक्रोबीड्स का उपयोग करने के लिए एक सरल तकनीक विकसित की गई है (चित्रा 1)। यहां, CRISPR / Cas9-इंजीनियर मानव सामान्य B2B सेल लाइनें जो अंतर्जात रूप से mNeonGreen21-10/11-टैग किए गए YAP को व्यक्त करती हैं, विधि को मान्य करने के लिए उपयोग की जाती हैं। वाईएपी एक मेचानो-संवेदनशील प्रोटीन है, और वाईएपी के स्थानांतरण को परमाणु मेकानो-सेंसिंग14,28 द्वारा नियंत्रित किया जाता है। CRISPR / Cas9-विनियमित नॉक-इन दृष्टिकोण को फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FP) mNeonGreen21-10/11 के साथ अंतर्जात वाईएपी को टैग करने के लिए चुना गया था। यद्यपि सीआरआईएसपीआर संपादन को अपूर्ण दक्षता और ऑफ-टारगेट प्रभाव के लिए जाना जाता है, पिछले प्रकाशनों में प्रोटोकॉल ने सही ओपन रीडिंग फ्रेम सम्मिलन52,53,54 के लिए चयन करने के लिए फ्लोरेसेंस सॉर्टिंग को एकीकृत किया। चयन की इस अतिरिक्त परत के साथ, पहले उत्पन्न 52,53,54,55 से पहले उत्पन्न20+ सेल लाइनों में कोई ऑफ-टारगेट टैगिंग घटना नहीं देखी गई थी। यह एक विभाजित फ्लोरोसेंट प्रोटीन निर्माण है, लेकिन सिद्धांत रूप में, कोई भी व्यक्त फ्लोरोसेंट टैग उपयोग करने योग्य हो सकता है। यह लेबलिंग दृष्टिकोण ट्रांसजीन या एंटीबॉडी विधियों से बेहतर है। सबसे पहले, ट्रांसजेन अभिव्यक्ति के विपरीत, टैग किया गया प्रोटीन एकल-प्रतिलिपि जीन खुराक बनाए रखता है और देशी जीन नियामक नेटवर्क के शारीरिक संदर्भ में व्यक्त करता है, प्रोटीन एकाग्रता, स्थानीयकरण और बातचीत में विचलन को सीमित करता है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली टैगिंग विधि पूर्ण एफपी टैगिंग की तुलना में उच्च थ्रूपुट और दक्षता प्राप्त करती है। यह निर्धारण कलाकृतियों और उच्च गुणवत्ता वाले, उच्च विशिष्टता एंटीबॉडी की सीमित उपलब्धता के कारण इम्यूनोफ्लोरेसेंस से जुड़ी चुनौतियों से भी बचता है। दूसरा, इस पेपर में उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण सेल फिजियोलॉजी के लिए न्यूनतम गड़बड़ी करता है और प्रामाणिक रूप से सभी अंतर्जात वाईएपी के वास्तविक समय के रहस्योद्घाटन को सक्षम बनाता है। इसके विपरीत, अन्य सामान्य ट्रांसजीन विधियां अक्सर वाईएपी के अतिवृद्धि का कारण बनती हैं। परिणामस्वरूप कृत्रिम वितरण संभावित रूप से साइटोटॉक्सिसिटी का कारण बन सकता है और कोशिकाओं56,57,58 के मेकानो-सेंसिंग को प्रभावित कर सकता है।
यह अध्ययन साइटोप्लाज्म में वितरित चुंबकीय माइक्रोबीड्स के माध्यम से नाभिक पर सीधे बल लागू करने और एक साथ लाइव-सेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग का संचालन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। सारांश में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं कि (1) नाभिक के बाहर सेल में चुंबकीय माइक्रोबीड्स कैसे वितरित किया जाए, (2) नाभिक पर चुंबकीय बल लागू करने के लिए माइक्रोबीड्स में हेरफेर करें, (3) हेरफेर के दौरान कोशिकाओं की कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट इमेजिंग करें, और (4) बल अनुप्रयोग प्रक्रिया के दौरान वाईएपी परमाणु / साइटोप्लाज्म (एन / सी) अनुपात का मात्रात्मक विश्लेषण करें। परिणाम बताते हैं कि (1) एंडोसाइटोसिस के माध्यम से, चुंबकीय माइक्रोबीड्स को 7 घंटे के भीतर बी 2 बी कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में गैर-आक्रामक रूप से वितरित किया जा सकता है (चित्रा 2 और चित्रा 3); और (2) नाभिक (चित्रा 4, चित्रा 5, और चित्रा 6) पर सीधे लागू मात्रात्मक चुंबकीय बल अकेले सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-इंजीनियर बी 2 बी कोशिकाओं (चित्रा 7 और चित्रा 8) में वाईएपी एन / सी अनुपात के विविध परिवर्तनों को ट्रिगर कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
चुंबकीय माइक्रोबीड्स (खंड 2.2) का आंतरिककरण महत्वपूर्ण है क्योंकि बाह्य माइक्रोबीड्स सीधे नाभिक पर बल लागू नहीं कर सकते हैं। बल अनुप्रयोग और इमेजिंग (धारा 5.3) इस प्रयोग में महत्वपूर्ण कदम हैं, और नाभिक को …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को यूएफ गेटोरेड अवार्ड स्टार्ट-अप पैकेज (एक्सटी), यूएफएचसीसी पायलट अवार्ड (एक्सटी और डॉ डाइटमार सीमैन), यूएफ अपॉर्चुनिटी सीड फंड (एक्सटी), और यूएफएचसीसी यूनिवर्सिटी स्कॉलर्स प्रोग्राम (एचवाई वांग) द्वारा वित्त पोषित किया गया है। हम ईमानदारी से डॉ जोनाथन लिच (यूएफएचसीसी), डॉ रॉल्फ रेने (यूएफएचसीसी), डॉ क्रिस्टोफर वल्पे (यूएफएचसीसी), डॉ ब्लैंका शर्मा (बीएमई), डॉ मार्क शेप्लाक (एमएई एंड ईसीई), डॉ डैनियल फेरिस (बीएमई), डॉ मालिसा सारंटिनोरानोंट (एमएई), डॉ अशोक कुमार (एमएई), डॉ बेंजामिन केसेलोव्स्की (बीएमई), डॉ ब्रेंट गिला (बीएमई), डॉ ब्रेंट गिला (बीएससीई), डॉ ब्रेंट गिला (बीएससीई) के साथ बौद्धिक चर्चाओं और तकनीकी सहायता की सराहना करते हैं। डॉ ग्रेगरी ए हुदल्ला (बीएमई), डॉ स्टीवन घिज्जानी (ओएसएसएम), डॉ येनिसेल क्रूज-अल्मीडा (सीडीबीएस), डॉ रोजर फिलिंगिम (सीडी-बीएस), डॉ रॉबर्ट कॉडल (ओएमएस), डॉ जॉन न्यूबर्ट (डीएन-ओआर), डॉ जस्टिन हिलियार्ड (न्यूरोसर्जरी), डॉ तियान हे (हार्वर्ड विश्वविद्यालय), डॉ यूहुआ टैन (हांगकांग पॉलिटेक्निक विश्वविद्यालय), डॉ जेसी एल-एस एयू (इंस्टीट्यूट ऑफ क्वांटिटेटिव सिस्टम्स फार्माकोलॉजी), डॉ डेविड हैन (यूनिवर्सिटी ऑफ एरिजोना), डॉ जेसी एल-एस एयू (इंस्टीट्यूट ऑफ क्वांटिटेटिव सिस्टम्स फार्माकोलॉजी), डॉ डेविड हैन (एमडी-बीएस), डॉ रॉबर्ट कॉडल (ओएमएस), डॉ जॉन न्यूबर्ट (डीएन-ओआर), डॉ जस्टिन हिलियार्ड (न्यूरोसर्जरी), डॉ तियान हे (हार्वर्ड विश्वविद्यालय), डॉ यूहुआ टैन (हांगकांग पॉलिटेक्निक विश्वविद्यालय), डॉ जेसी एल-एस एयू (मात्रात्मक प्रणाली फार्माकोलॉजी संस्थान), डॉ डेविड हैन (डीओआई)। और निकॉन की समर्थन टीम (डॉ जोस सेरानो-वेलेज़, लैरी कोर्डन और जॉन एकमैन)। हम तांग, यामागुची, शर्मा, एयू, सीमैन और गुआन की अनुसंधान प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों और यूएफ एमएई विभाग के सभी कर्मचारियों के प्रभावी समर्थन के लिए गहराई से आभारी हैं।
Materials
| 0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
| 25 cm2 flask | Corning | 156340 | |
| 7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads | N/A | N/A | |
| A1R confocal system | Nikon | ||
| Carbonyl Iron Powder CM | BASF | 30042253 | Magnetic microbead |
| Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
| Desktop Computer | Dell | with Windows 10 operating system | |
| Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
| Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
| Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Magnet | K&J Magnetics, Inc. | D99-N52 | |
| Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
| NIS-Elements software platform | Nikon | software platform | |
| Nucleus mask ImageJ macro | https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask | ||
| NucSpot Live 650 | Biotium | #40082 | Nuclear stain |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Ti2-E inverted microscope | Nikon | ||
| XYZ mover (CAD files) | https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover |
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