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생물학

Combinazione di attuatore di forza magnetica 3D e imaging a fluorescenza multifunzionale per studiare la meccanobiologia del nucleo

Published: July 05, 2022
doi:
10.3791/64098
, , , , , , , , ,
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering,University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering,University of Florida, 3Department of Biostatistics,University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE),University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center,University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences,University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine,University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering,University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics,University of Florida

Summary

Questo studio presenta un nuovo protocollo per applicare direttamente la forza meccanica sul nucleo cellulare attraverso microsfere magnetiche consegnate nel citoplasma e per condurre simultanee immagini fluorescenti di cellule vive.

Abstract

Una questione fondamentale in meccanobiologia è come le cellule viventi percepiscono gli stimoli meccanici extracellulari nel contesto della fisiologia e della patologia cellulare. Si ritiene che la meccano-sensazione cellulare degli stimoli meccanici extracellulari sia attraverso i recettori di membrana, il complesso proteico associato e il citoscheletro. I recenti progressi nella meccanobiologia dimostrano che il nucleo cellulare nel citoplasma stesso può percepire indipendentemente gli stimoli meccanici contemporaneamente. Tuttavia, manca una comprensione meccanicistica di come il nucleo cellulare percepisce, trasduce e risponde agli stimoli meccanici, principalmente a causa delle sfide tecniche nell’accesso e nella quantificazione della meccanica del nucleo con strumenti convenzionali. Questo documento descrive la progettazione, la fabbricazione e l’implementazione di un nuovo attuatore di forza magnetica che applica stimoli meccanici 3D precisi e non invasivi per deformare direttamente il nucleo cellulare. Utilizzando cellule ingegnerizzate con CRISPR / Cas9, questo studio dimostra che questo strumento, combinato con l’imaging fluorescente confocale ad alta risoluzione, consente la rivelazione della dinamica in tempo reale di una proteina associata al sì meccano-sensibile (YAP) in singole cellule in funzione della deformazione del nucleo. Questo semplice metodo ha il potenziale per colmare l’attuale divario tecnologico nella comunità meccanobiologica e fornire risposte al divario di conoscenze che esiste nella relazione tra meccanotrasduzione del nucleo e funzione cellulare.

Introduction

Questo studio mira a sviluppare e applicare una nuova tecnica per chiarire la meccanobiologia del nucleo combinando gli attuatori magnetici che applicano la forza meccanica direttamente sul nucleo cellulare e la microscopia a fluorescenza confocale che visualizza simultaneamente i cambiamenti subcellulari strutturali e funzionali. Le cellule rilevano segnali biofisici extracellulari tra cui rigidità tissutale 1,2,3,4, pressione del liquido interstiziale e sforzo di taglio 5,6,7, topologia / geometria di superficie8,9,10,11,12 e tensione / sforzo di compressione 13,14, 15,16. I segnali biofisici vengono convertiti in segnali biochimici e innescano potenziali cambiamenti a valle dell’espressione genica e dei comportamenti cellulari, un processo noto come meccanotrasduzione 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Per studiare i processi di meccanotrasduzione, sono state sviluppate una miriade di tecniche per applicare la forza meccanica sulle cellule, come la microscopia a forza atomica28, il dispositivo di allungamento cellulare29, il sensore di forza bio-MEMS (sistemi micro-elettromeccanici) 15,30,31, la reologia di taglio 32 e il sistema di visione stereoscopica 33 . Una recente revisione riassume gli approcci per applicare segnali meccanici extracellulari e interferire con il meccanorilevamento34. Ad oggi, la maggior parte di questi metodi applica forza sulla membrana plasmatica cellulare e le cellule ricevono direttamente questi segnali biofisici extracellulari attraverso recettori di membrana come integrina, caderina, canali ionici e recettori accoppiati a proteine G. Successivamente, trasmettono il segnale al citoscheletro intracellulare e al nucleo. Ad esempio, utilizzando la traslocazione di proteine associate sì (YAP) come indicatore di meccano-rilevamento, le cellule hanno dimostrato di percepire i segnali meccanici di rigidità del substrato e tensione extracellulare dalla membrana cellulare e trasmetterli attraverso il citoscheletro nel nucleo per indurre la traslocazione da citoplasma YAP a nucleo28,35.

Prove recenti suggeriscono che il nucleo cellulare stesso è un meccano-sensore indipendente 8,36,37. Ciò è dimostrato da esperimenti condotti sul nucleo isolato raccolto dalle cellule, dove è stato rivelato che i nuclei cambiano in modo adattivo la loro rigidità in risposta alla forza meccanica applicata direttamente su di essi36. Durante molte condizioni fisiologiche, i nuclei sia nelle cellule tumorali che in quelle sane percepiscono segnali biofisici extracellulari e cambiano le loro proprietà meccaniche e gli assemblaggi38,39,40. Ad esempio, dopo lo stravaso, la rigidità nucleare delle cellule tumorali diminuisce e mantiene la morbidezza per oltre 24 ore38. Durante la migrazione attraverso lo spazio interstiziale confinato, i nuclei delle cellule tumorali spesso perdono e recuperano la loro integrità strutturale39. Tuttavia, il modo in cui il nucleo percepisce il segnale biofisico è sconosciuto, sebbene siano state trovate coinvolte diverse proteine dell’involucro nucleare e famiglie di proteine, come Lamin A / C e linker del complesso nucleoscheletro e citoscheletro (LINC)38,41. Quindi, nuovi metodi non invasivi che possono applicare direttamente la forza al nucleo disaccoppiano l’effetto della trasmissione della forza dalla membrana cellulare-plasma e dal citoscheletro e aiuteranno a chiarire i meccanismi molecolari precedentemente inaccessibili del meccano-rilevamento nucleare.

La ricerca che ha impiegato pinzette ottiche per manipolare organelli42 e microsfere iniettate nelle cellule43 ha mostrato la capacità tecnologica di applicare direttamente la forza sul nucleo. Tuttavia, la tecnica delle pinzette ottiche ha diverse limitazioni: (1) le pinzette ottiche a bassa produttività spesso manipolano solo una cellula o microbead alla volta; e (2) il potenziale fotodanneggiamento e la deformazione dell’artefatto di temperatura del nucleare richiedono decine di pN36 e la corrispondente potenza laser necessaria è di circa 10 mW per pN44,45. Tale intensità laser è sufficiente per innescare il fotodanneggiamento nelle cellule e perturbare le funzioni delle cellule durante l’esperimento46.

La forza magnetica applicata attraverso microsfere all’interno delle cellule viventi mostra il potenziale per applicare direttamente la forza sul nucleo e supera i limiti delle pinzette ottiche. Una volta che le microsfere vengono consegnate nel citoplasma, un campo magnetico può esercitare una forza magnetica su più microsfere contemporaneamente in modo ad alto rendimento. Il campo magnetico non influenza le funzioni cellulari47, ma genera forza da pN a nN, che è sufficiente per indurre la deformazione nucleare 36,48,49. Ad oggi, la manipolazione delle microsfere magnetiche è stata applicata sulla membrana plasmatica cellulare48, all’interno del citoplasma50, sulla F-actina51, all’interno del nucleo47 e sul nucleo isolato36. Tuttavia, la manipolazione magnetica delle microsfere non è mai stata utilizzata per applicare una forza meccanica diretta sull’involucro nucleare per studiare la meccanotrasduzione nel nucleo.

In questo articolo, viene sviluppata una semplice tecnica per fornire in modo non invasivo microsfere magnetiche nel citoplasma e utilizzare queste microsfere per applicare forza meccanica sul nucleo (Figura 1). Qui, le normali linee cellulari B2B umane ingegnerizzate da CRISPR / Cas9 che esprimono endogenamente mNeonGreen21-10/11-tagged YAP vengono utilizzate per convalidare il metodo. YAP è una proteina meccano-sensibile e la traslocazione di YAP è regolata dal meccano-rilevamento nucleare14,28. L’approccio knock-in regolato da CRISPR / Cas9 è stato scelto per etichettare YAP endogeno con una proteina fluorescente (FP) mNeonGreen21-10/11. Sebbene l’editing CRISPR sia noto per avere un’efficienza incompleta e un effetto fuori bersaglio, i protocolli nelle pubblicazioni precedenti hanno integrato l’ordinamento a fluorescenza per selezionare il corretto inserimento del frame di lettura aperto52,53,54. Con questo ulteriore livello di selezione, non è stato osservato alcun evento di tagging off-target in 20+ linee cellulari precedentemente generate52,53,54,55. Questo è un costrutto proteico fluorescente diviso, ma in linea di principio, qualsiasi tag fluorescente esprimibile potrebbe essere utilizzabile. Questo approccio di etichettatura è superiore ai metodi transgenici o anticorpali. In primo luogo, a differenza dell’espressione transgenica, la proteina marcata mantiene il dosaggio genico a copia singola ed si esprime nel contesto fisiologico della rete di regolazione genica nativa, limitando le deviazioni nella concentrazione, localizzazione e interazione della proteina. Il metodo di tagging utilizzato in questo studio raggiunge un throughput e un’efficienza superiori di oltre un ordine di grandezza rispetto all’etichettatura FP completa. Evita anche le sfide associate all’immunofluorescenza a causa degli artefatti di fissazione e della limitata disponibilità di anticorpi di alta qualità e ad alta specificità. In secondo luogo, l’approccio utilizzato in questo articolo riduce al minimo le perturbazioni della fisiologia cellulare e consente la rivelazione in tempo reale di tutti gli YAP endogeni in modo autentico. Al contrario, altri metodi transgenici comuni spesso portano alla sovraespressione di YAP. La distribuzione artificiale risultante può potenzialmente causare citotossicità e influenzare il meccano-rilevamento delle cellule56,57,58.

Questo studio presenta un protocollo per applicare direttamente la forza sul nucleo attraverso microsfere magnetiche consegnate nel citoplasma e per condurre simultanee immagini fluorescenti a cellule vive. In sintesi, i protocolli qui presentati dimostrano come (1) fornire microsfere magnetiche nella cellula mentre si trova all’esterno del nucleo, (2) manipolare le microsfere per applicare forza magnetica sul nucleo, (3) eseguire l’imaging fluorescente confocale delle cellule durante la manipolazione e (4) analizzare quantitativamente il rapporto YAP nucleare/citoplasma (N/C) durante tutto il processo di applicazione della forza. I risultati suggeriscono che (1) attraverso l’endocitosi, le microsfere magnetiche possono essere erogate in modo non invasivo nel citoplasma delle cellule B2B entro 7 ore (Figura 2 e Figura 3); e (2) la forza magnetica quantificata applicata direttamente sul nucleo (Figura 4, Figura 5 e Figura 6) da sola può innescare diversi cambiamenti del rapporto YAP N/C nelle cellule B2B ingegnerizzate da CRISPR / Cas9 (Figura 7 e Figura 8).

Protocol

1. Mantenimento di cellule B2B ingegnerizzate con CRISPR / Cas9 Coltura di cellule B2B in un pallone T25 con RPMI-1640 integrato con il 10% di siero bovino fetale e l’1% di penicillina-streptomicina. Mantenere le celle B2B in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2. Sottocoltura delle cellule B2B quando la confluenza raggiunge il 70% all’80%. Conservare la linea cellulare B2B in terreno di coltura RPMI-1640 con DMSO al 10% (v/v) in un congela…

Representative Results

Progettazione di un dispositivo di movimento magnetico e applicazione della forza magneticaPer applicare forza sul nucleo attraverso le microsfere magnetiche, è stato progettato e costruito un dispositivo di movimento magnetico per controllare la posizione spaziale del magnete. Il dispositivo di spostamento del magnete contiene un telaio centrale, tre manopole e guide per spostare il magnete collegato nelle direzioni x, y e z indipendentemente alla risoluzione spaziale di 1,59 mm per ciclo (<strong …

Discussion

L’internalizzazione delle microsfere magnetiche (sezione 2.2) è fondamentale perché le microsfere extracellulari non possono applicare forza direttamente al nucleo. L’applicazione della forza e l’imaging (sezione 5.3) sono passaggi critici in questo esperimento e la forza necessaria per deformare il nucleo e indurre conseguenze biologiche significative potrebbe dipendere dal campione. La grandezza della forza in questo esperimento (0,8 nN e 1,4 nN) può essere ulteriormente aumentata per innescare il rilevamento meccan…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto è finanziato da UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. e Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) e UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Apprezziamo sinceramente le discussioni intellettuali e il supporto tecnico del Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurochirurgia), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (University of Arizona), e il team di supporto di Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon e Jon Ekman). Siamo profondamente grati per l’efficace supporto di tutti i membri dei laboratori di ricerca di Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann e Guan e di tutti i membri del personale del Dipartimento UF MAE.

Materials

0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover
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References

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Keywords: 3D Magnetic Force ActuatorMulti-functional Fluorescence ImagingNucleus MechanobiologyMagnetic MicrobeadsCell InternalizationConfocal Fluorescence ImagingLive-cell ImagingNuclear StainYES-associated Protein (YAP)Cell BoundaryCytoskeletonOptical TweezersCell FunctionsHigh Throughput
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Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).
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