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생물학

Combinación de actuador de fuerza magnética 3D e imágenes de fluorescencia multifuncionales para estudiar la mecanobiología del núcleo

Published: July 05, 2022
doi:
10.3791/64098
, , , , , , , , ,
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering,University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering,University of Florida, 3Department of Biostatistics,University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE),University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center,University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences,University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine,University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering,University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics,University of Florida

Summary

Este estudio presenta un nuevo protocolo para aplicar directamente fuerza mecánica en el núcleo celular a través de microperlas magnéticas entregadas en el citoplasma y para realizar imágenes fluorescentes simultáneas de células vivas.

Abstract

Una pregunta fundamental en mecanobiología es cómo las células vivas perciben los estímulos mecánicos extracelulares en el contexto de la fisiología y patología celular. Se cree que la mecano-sensación celular de los estímulos mecánicos extracelulares es a través de los receptores de membrana, el complejo proteico asociado y el citoesqueleto. Los avances recientes en mecanobiología demuestran que el núcleo celular en el citoplasma puede detectar independientemente los estímulos mecánicos simultáneamente. Sin embargo, falta una comprensión mecanicista de cómo el núcleo celular detecta, transduce y responde a los estímulos mecánicos, principalmente debido a los desafíos técnicos para acceder y cuantificar la mecánica del núcleo mediante herramientas convencionales. Este documento describe el diseño, fabricación e implementación de un nuevo actuador de fuerza magnética que aplica estímulos mecánicos 3D precisos y no invasivos para deformar directamente el núcleo celular. Utilizando células diseñadas con CRISPR / Cas9, este estudio demuestra que esta herramienta, combinada con imágenes fluorescentes confocales de alta resolución, permite la revelación de la dinámica en tiempo real de una proteína asociada a sí mecanosensible (YAP) en células individuales en función de la deformación del núcleo. Este método simple tiene el potencial de cerrar la brecha tecnológica actual en la comunidad mecanobiológica y proporcionar respuestas a la brecha de conocimiento que existe en la relación entre la mecanotransducción del núcleo y la función celular.

Introduction

Este estudio tiene como objetivo desarrollar y aplicar una nueva técnica para dilucidar la mecanobiología del núcleo mediante la combinación de los actuadores magnéticos que aplican fuerza mecánica directamente sobre el núcleo celular y la microscopía de fluorescencia confocal que simultáneamente imágenes de los cambios subcelulares estructurales y funcionales. Las células detectan señales biofísicas extracelulares, incluida la rigidez tisular 1,2,3,4, la presión del líquido intersticial y la tensión de cizallamiento 5,6,7, la topología/geometría de la superficie8,9,10,11,12 y la tensión / tensión de compresión 13,14, 15,16. Las señales biofísicas se convierten en señales bioquímicas y desencadenan posibles cambios posteriores de la expresión génica y los comportamientos celulares, un proceso conocido como mecanotransducción 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Para estudiar los procesos de mecanotransducción, se han desarrollado una miríada de técnicas para aplicar fuerza mecánica en las células, como la microscopía de fuerza atómica28, el dispositivo de estiramiento celular29, el sensor de fuerza bio-MEMS (sistemas microelectromecánicos) 15,30,31, la reología de cizallamiento 32 y el sistema de visión estéreo 33 . Una revisión reciente resume los enfoques para aplicar señales mecánicas extracelulares e interferir con la mecanodetección34. Hasta la fecha, la mayoría de estos métodos aplican fuerza sobre la membrana plasmática celular, y las células reciben directamente estas señales biofísicas extracelulares a través de receptores de membrana como integrina, cadherina, canales iónicos y receptores acoplados a proteínas G. Posteriormente, transmiten la señal al citoesqueleto y núcleo intracelular. Por ejemplo, utilizando la translocación de proteínas asociadas a sí (YAP) como indicador de mecanodetección, se muestra que las células detectan las señales mecánicas de rigidez del sustrato y tensión extracelular de la membrana celular y las transmiten a través del citoesqueleto al núcleo para inducir la translocación de citoplasma a núcleo YAP28,35.

La evidencia reciente sugiere que el núcleo celular en sí es un mecano-sensor independiente 8,36,37. Esto es probado por experimentos realizados en el núcleo aislado cosechado de las células, donde se reveló que los núcleos cambian adaptativamente su rigidez en respuesta a la fuerza mecánica aplicada directamente sobre ellos36. Durante muchas condiciones fisiológicas, los núcleos tanto en las células tumorales como en las sanas detectan señales biofísicas extracelulares y cambian sus propiedades mecánicas y ensamblajes38,39,40. Por ejemplo, tras la extravasación, la rigidez nuclear de las células tumorales disminuye y mantiene la suavidad durante más de 24 h38. Durante la migración a través del espacio intersticial confinado, los núcleos de las células tumorales frecuentemente pierden y recuperan su integridad estructural39. Sin embargo, se desconoce la forma en que el núcleo detecta la señal biofísica, aunque se ha encontrado que varias proteínas de la envoltura nuclear y familias de proteínas están involucradas, como Lamin A / C y el complejo de enlace de nucleoesqueleto y citoesqueleto (LINC)38,41. Por lo tanto, los nuevos métodos no invasivos que pueden aplicar fuerza directamente al núcleo desacoplarán el efecto de la transmisión de fuerza desde la membrana plasmática celular y el citoesqueleto, y ayudarán a dilucidar los mecanismos moleculares previamente inaccesibles de la mecanodetección nuclear.

La investigación que empleó pinzas ópticas para manipular orgánulos42 y microperlas inyectadas en las células43 mostró la capacidad tecnológica de aplicar fuerza directamente sobre el núcleo. Sin embargo, la técnica de pinzas ópticas tiene varias limitaciones: (1) las pinzas ópticas de bajo rendimiento a menudo solo manipulan una célula o microperla a la vez; y (2) el fotodaño potencial y la deformación del artefacto de temperatura de la energía nuclear requieren decenas de pN36, y la potencia láser necesaria correspondiente es de aproximadamente 10 mW por pN44,45. Tal intensidad del láser es suficiente para desencadenar fotodaño en las células y perturbar las funciones celulares durante el experimento46.

La fuerza magnética aplicada a través de microperlas dentro de las células vivas muestra el potencial de aplicar fuerza directamente sobre el núcleo y supera las limitaciones de las pinzas ópticas. Una vez que las microperlas se entregan en el citoplasma, un campo magnético puede ejercer una fuerza magnética sobre múltiples microperlas simultáneamente de una manera de alto rendimiento. El campo magnético no influye en las funciones celulares47, pero genera fuerza de pN a nN, que es suficiente para inducir la deformación nuclear 36,48,49. Hasta la fecha, la manipulación de microperlas magnéticas se ha aplicado en la membrana plasmática celular48, dentro del citoplasma50, en la actina F51, dentro del núcleo47 y en el núcleo aislado36. Sin embargo, la manipulación magnética de microperlas nunca se ha utilizado para aplicar fuerza mecánica directa sobre la envoltura nuclear para estudiar la mecanotransducción en el núcleo.

En este documento, se desarrolla una técnica simple para administrar microperlas magnéticas de forma no invasiva en el citoplasma y utilizar estas microperlas para aplicar fuerza mecánica sobre el núcleo (Figura 1). Aquí, se utilizan líneas celulares B2B normales humanas diseñadas por CRISPR / Cas9 que expresan endógenamente YAP marcado con mNeonGreen21-10 / 11 para validar el método. YAP es una proteína mecanosensible, y la translocación de YAP está regulada por la mecanodetección nuclear 14,28. Se eligió el enfoque knock-in regulado por CRISPR/Cas9 para marcar YAP endógeno con una proteína fluorescente (FP) mNeonGreen21-10/11. Aunque se sabe que la edición CRISPR tiene una eficiencia incompleta y un efecto fuera del objetivo, los protocolos en publicaciones anteriores integraron la clasificación de fluorescencia para seleccionar la inserción correcta del marco de lectura abierto52,53,54. Con esta capa adicional de selección, no se observó ningún evento de etiquetado fuera del objetivo en 20+ líneas celulares generadas previamente52,53,54,55. Esta es una construcción de proteína fluorescente dividida, pero en principio, cualquier etiqueta fluorescente expresable podría ser utilizable. Este enfoque de etiquetado es superior a los métodos transgénicos o de anticuerpos. Primero, a diferencia de la expresión transgénica, la proteína marcada mantiene la dosis del gen de copia única y se expresa en el contexto fisiológico de la red reguladora de genes nativos, limitando las desviaciones en la concentración, localización e interacción de proteínas. El método de etiquetado utilizado en este estudio logra un rendimiento y una eficiencia más altos en un orden de magnitud que el etiquetado FP completo. También evita los desafíos asociados con la inmunofluorescencia debido a los artefactos de fijación y la disponibilidad limitada de anticuerpos de alta calidad y alta especificidad. En segundo lugar, el enfoque utilizado en este documento hace una perturbación mínima a la fisiología celular y permite la revelación en tiempo real de todos los YAP endógenos auténticamente. En contraste, otros métodos transgénicos comunes a menudo conducen a la sobreexpresión de YAP. La distribución artificial resultante puede potencialmente causar citotoxicidad y afectar la mecanodetección de las células56,57,58.

Este estudio presenta un protocolo para aplicar fuerza directamente sobre el núcleo a través de microperlas magnéticas entregadas en el citoplasma y para realizar imágenes fluorescentes simultáneas de células vivas. En resumen, los protocolos presentados aquí demuestran cómo (1) entregar microperlas magnéticas en la célula mientras está fuera del núcleo, (2) manipular las microperlas para aplicar fuerza magnética en el núcleo, (3) realizar imágenes fluorescentes confocales de las células durante la manipulación, y (4) analizar cuantitativamente la relación nuclear / citoplasma (N / C) de YAP durante todo el proceso de aplicación de fuerza. Los resultados sugieren que (1) a través de endocitosis, las microperlas magnéticas pueden administrarse de forma no invasiva en el citoplasma de las células B2B dentro de las 7 h (Figura 2 y Figura 3); y (2) la fuerza magnética cuantificada aplicada directamente sobre el núcleo (Figura 4, Figura 5 y Figura 6) por sí sola puede desencadenar diversos cambios en la relación YAP N/C en células B2B diseñadas con CRISPR / Cas9 (Figura 7 y Figura 8).

Protocol

1. Mantenimiento de células B2B diseñadas con CRISPR/Cas9 Cultivo de células B2B en un matraz T25 con RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina. Mantener las células B2B en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% deCO2. Subcultivo de las células B2B cuando la confluencia alcanza el 70% al 80%. Almacene la línea celular B2B en medio de cultivo RPMI-1640 con DMSO al 10% (v/v) en un congelador de -80 °…

Representative Results

Diseño de un dispositivo de movimiento magnético y aplicación de fuerza magnéticaPara aplicar fuerza sobre el núcleo a través de las microperlas magnéticas, se diseñó y construyó un dispositivo de movimiento magnético para controlar la posición espacial del imán. El dispositivo de movimiento magnético contiene un marco central, tres perillas y rieles para mover el imán conectado en direcciones x, y y z de forma independiente a la resolución espacial de 1,59 mm por ciclo (<strong class…

Discussion

La internalización de microperlas magnéticas (sección 2.2) es crítica porque las microperlas extracelulares no pueden aplicar fuerza directamente al núcleo. La aplicación de fuerza y la obtención de imágenes (sección 5.3) son pasos críticos en este experimento, y la fuerza necesaria para deformar el núcleo e inducir consecuencias biológicas significativas podría depender de la muestra. La magnitud de la fuerza en este experimento (0,8 nN y 1,4 nN) se puede aumentar aún más para desencadenar la detección d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este proyecto está financiado por UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), el UFHCC Pilot Award (X. T. y el Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) y UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Agradecemos sinceramente las discusiones intelectuales y el apoyo técnico del Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE y ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dra. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurocirugía), Dr. Tian He (Universidad de Harvard), Dr. Youhua Tan (Universidad Politécnica de Hong Kong), Dr. Jessie L-S Au (Instituto de Farmacología de Sistemas Cuantitativos), Dr. David Hahn (Universidad de Arizona), y el equipo de soporte de Nikon (Drs. José Serrano-Vélez, Larry Kordon y Jon Ekman). Estamos profundamente agradecidos por el apoyo efectivo de todos los miembros de los laboratorios de investigación de Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann y Guan y todos los miembros del personal del Departamento MAE de UF.

Materials

0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover
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References

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Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).
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