JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Kombinera 3D-magnetiskt kraftställdon och multifunktionell fluorescensavbildning för att studera kärnmekanobiologi

Published: July 05, 2022
doi:
10.3791/64098
, , , , , , , , ,
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering,University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering,University of Florida, 3Department of Biostatistics,University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE),University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center,University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences,University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine,University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering,University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics,University of Florida

Summary

Denna studie presenterar ett nytt protokoll för att direkt applicera mekanisk kraft på cellkärnan genom magnetiska mikrober som levereras in i cytoplasman och för att genomföra samtidig fluorescerande avbildning av levande celler.

Abstract

En grundläggande fråga inom mekanobiologin är hur levande celler känner av extracellulära mekaniska stimuli i samband med cellfysiologi och patologi. Den cellulära mekano-känslan av extracellulära mekaniska stimuli tros vara genom membranreceptorerna, det associerade proteinkomplexet och cytoskeletten. Nya framsteg inom mekanobiologi visar att cellkärnan i cytoplasma själv självständigt kan känna av mekaniska stimuli samtidigt. En mekanistisk förståelse av hur cellkärnan känner av, omvandlar och svarar på mekaniska stimuli saknas dock, främst på grund av de tekniska utmaningarna med att komma åt och kvantifiera kärnmekaniken med konventionella verktyg. Detta dokument beskriver design, tillverkning och implementering av ett nytt magnetiskt kraftställdon som tillämpar exakta och icke-invasiva 3D-mekaniska stimuli för att direkt deformera cellkärnan. Med hjälp av CRISPR/Cas9-konstruerade celler visar denna studie att detta verktyg, i kombination med högupplöst konfokal fluorescerande avbildning, möjliggör avslöjandet av realtidsdynamiken hos ett mekanokänsligt ja-associerat protein (YAP) i enskilda celler som en funktion av kärndeformation. Denna enkla metod har potential att överbrygga det nuvarande teknikgapet i mekanobiologisamhället och ge svar på den kunskapslucka som finns i förhållandet mellan kärnmekanotransduktion och cellfunktion.

Introduction

Denna studie syftar till att utveckla och tillämpa en ny teknik för att belysa kärnmekanobiologi genom att kombinera de magnetiska ställdonen som applicerar mekanisk kraft direkt på cellkärnan och den konfokala fluorescensmikroskopin som samtidigt avbildar de strukturella och funktionella subcellulära förändringarna. Celler känner av extracellulära biofysiska signaler inklusive vävnadsstyvhet 1,2,3,4, interstitiellt vätsketryck och skjuvspänning 5,6,7, yttopologi/geometri 8,9,10,11,12 och spännings-/kompressionsspänning13,14, 15,16. Biofysiska signaler omvandlas till biokemiska signaler och utlöser potentiella nedströmsförändringar av genuttryck och cellbeteenden – en process som kallas mekanotransduktion 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . För att studera mekanotransduktionsprocesser har en myriad av tekniker utvecklats för att tillämpa mekanisk kraft på cellerna, såsom atomkraftmikroskopi28, cellsträckningsanordning29, bio-MEMS (mikroelektromekaniska system) kraftsensor 15,30,31, skjuvreologi 32 och Stereo Vision System 33 . En ny granskning sammanfattar metoderna för att tillämpa extracellulära mekaniska ledtrådar och störa mekanosensering34. Hittills tillämpar de flesta av dessa metoder kraft på cellplasmamembranet, och celler tar direkt emot dessa extracellulära biofysiska signaler via membranreceptorer såsom integrin, kadherin, jonkanaler och G-proteinkopplade receptorer. Därefter sänder de signalen till den intracellulära cytoskeletten och kärnan. Till exempel, med hjälp av ja-associerad protein (YAP) translokation som en indikator på mekano-avkänning, visas celler att känna av de mekaniska signalerna om substratstyvhet och extracellulär spänning från cellmembranet och överföra dem genom cytoskeletten till kärnan för att inducera YAP-cytoplasma-till-kärntranslokation28,35.

Nya bevis tyder på att själva cellkärnan är en oberoende mekanosensor 8,36,37. Detta bevisas av experiment som utförs på den isolerade kärnan som skördats från celler, där det avslöjades att kärnor adaptivt ändrar sin styvhet som svar på den mekaniska kraften som direkt appliceras på dem36. Under många fysiologiska förhållanden känner kärnor i både tumör- och friska celler av extracellulära biofysiska signaler och ändrar deras mekaniska egenskaper och sammansättningar38,39,40. Till exempel, vid extravasation, minskar tumörcellernas kärnstyvhet och upprätthåller mjukhet i över 24 timmar38. Under migration genom begränsat interstitiellt utrymme förlorar kärnorna i tumörceller ofta och återställer sin strukturella integritet39. Hur kärnan känner av den biofysiska signalen är dock okänt, även om flera kärnhöljeproteiner och familjer av proteiner har visat sig vara inblandade, såsom Lamin A / C och linker av nukleoskelett och cytoskelett (LINC) komplex38,41. Därför kommer nya icke-invasiva metoder som direkt kan applicera kraft på kärnan att frikoppla effekten av kraftöverföring från cellplasmamembranet och cytoskelettet och kommer att hjälpa till att belysa de tidigare otillgängliga molekylära mekanismerna för kärnmekanoavkänning.

Forskning som använde optisk pincett för att manipulera organeller42 och mikrober injicerade i celler43 visade den tekniska förmågan att direkt applicera kraft på kärnan. Den optiska pincetttekniken har emellertid flera begränsningar: (1) optisk pincett med låg genomströmning manipulerar ofta bara en cell eller mikrob åt gången; och (2) potentiell fotoskada och temperatur artefakt-deformation av kärnkraft kräver tiotals pN36, och motsvarande nödvändiga lasereffekt är cirka 10 mW per pN44,45. Sådan laserintensitet är tillräcklig för att utlösa fotoskador i cellerna och störa cellfunktionerna under experimentet46.

Magnetisk kraft applicerad genom mikrober i levande celler visar potentialen att direkt applicera kraft på kärnan och övervinner begränsningarna hos optisk pincett. När mikrober levereras in i cytoplasman kan ett magnetfält utöva en magnetisk kraft på flera mikrober samtidigt på ett sätt med hög genomströmning. Magnetfältet påverkar inte cellfunktioner47, men genererar kraft från pN till nN, vilket är tillräckligt för att inducera kärndeformation 36,48,49. Hittills har manipulation av magnetiska mikrober applicerats på cellplasmamembran48, inuti cytoplasman50, på F-aktin51, inuti kärnan47 och på den isolerade kärnan36. Magnetisk manipulation av mikrober har emellertid aldrig använts för att applicera direkt mekanisk kraft på kärnhöljet för att studera mekanotransduktion i kärnan.

I detta dokument utvecklas en enkel teknik för att icke-invasivt leverera magnetiska mikrober till cytoplasman och använda dessa mikrober för att applicera mekanisk kraft på kärnan (figur 1). Här används CRISPR / Cas9-konstruerade mänskliga normala B2B-cellinjer som endogent uttrycker mNeonGreen21-10/11-taggad YAP för att validera metoden. YAP är ett mekanokänsligt protein, och translokationen av YAP regleras av kärnmekanoavkännande 14,28. Den CRISPR/Cas9-reglerade knock-in-metoden valdes för att märka endogen YAP med ett fluorescerande protein (FP) mNeonGreen21-10/11. Även om CRISPR-redigering är känd för att ha ofullständig effektivitet och off-target-effekt, integrerade protokollen i tidigare publikationer fluorescenssortering för att välja för korrekt öppen läsraminsättning52,53,54. Med detta ytterligare urvalslager observerades ingen taggningshändelse utanför målet i 20+ cellinjer som tidigare genererat52,53,54,55. Detta är en delad fluorescerande proteinkonstruktion, men i princip kan vilken uttryckbar fluorescerande tagg som helst vara användbar. Denna märkningsmetod är överlägsen transgen- eller antikroppsmetoder. För det första, till skillnad från transgenuttrycket, upprätthåller det taggade proteinet enkopiegendosering och uttrycker sig i det fysiologiska sammanhanget för det inhemska genreglerande nätverket, vilket begränsar avvikelser i proteinkoncentration, lokalisering och interaktion. Taggningsmetoden som används i denna studie uppnår över en storleksordning högre genomströmning och effektivitet än full FP-taggning. Det undviker också utmaningar i samband med immunofluorescens på grund av fixeringsartefakter och den begränsade tillgången på högkvalitativa antikroppar med hög specificitet. För det andra gör tillvägagångssättet som används i detta dokument minimal störning av cellfysiologin och möjliggör realtidsuppenbarelse av alla endogena YAP: er autentiskt. Däremot leder andra vanliga transgenmetoder ofta till överuttryck av YAP. Den resulterande artificiella fördelningen kan potentiellt orsaka cytotoxicitet och påverka mekanoavkänning av celler56,57,58.

Denna studie presenterar ett protokoll för att direkt applicera kraft på kärnan genom magnetiska mikrober som levereras in i cytoplasman och för att genomföra samtidig fluorescerande avbildning av levande celler. Sammanfattningsvis visar protokollen som presenteras här hur man (1) levererar magnetiska mikrober in i cellen utanför kärnan, (2) manipulerar mikroberna för att applicera magnetisk kraft på kärnan, (3) utför konfokal fluorescerande avbildning av cellerna under manipulation och (4) kvantitativt analyserar YAP-kärn- / cytoplasmaförhållandet (N / C) under hela kraftapplikationsprocessen. Resultaten tyder på att (1) genom endocytos kan magnetiska mikrober icke-invasivt levereras till cytoplasman hos B2B-celler inom 7 timmar (figur 2 och figur 3); och (2) kvantifierad magnetisk kraft som appliceras direkt på kärnan (figur 4, figur 5 och figur 6) ensam kan utlösa olika förändringar av YAP N / C-förhållandet i CRISPR / Cas9-konstruerade B2B-celler (figur 7 och figur 8).

Protocol

1. Underhåll av CRISPR/Cas9-konstruerade B2B-celler Odla B2B-celler i en T25-kolv med RPMI-1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin. Håll B2B-cellerna i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5%CO2. Subkultur B2B-cellerna när sammanflödet når 70% till 80%. Förvara B2B-cellinjen i RPMI-1640 odlingsmedium med 10% (v / v) DMSO i en -80 ° C frys. Använd B2B-cellerna med ett passagenummer mindre än 10 i exper…

Representative Results

Design av en magnetrörlig anordning och applicering av magnetisk kraftFör att applicera kraft på kärnan genom de magnetiska mikropärlorna designades och byggdes en magnetrörlig anordning för att styra magnetens rumsliga position. Den magnetförflyttningsanordningen innehåller en central ram, tre vred och skenor för att flytta den bifogade magneten i x-, y- och z-riktningar oberoende av varandra med en rumslig upplösning på 1,59 mm per cykel (figur 1A). När ma…

Discussion

Internalisering av magnetiska mikrober (avsnitt 2.2) är avgörande eftersom extracellulära mikrober inte kan applicera kraft direkt på kärnan. Krafttillämpning och avbildning (avsnitt 5.3) är kritiska steg i detta experiment, och den kraft som behövs för att deformera kärnan och inducera meningsfulla biologiska konsekvenser kan vara provberoende. Kraftstorleken i detta experiment (0,8 nN och 1,4 nN) kan ökas ytterligare för att utlösa kärnmekanoavkänning i mindre känsliga celler.

<p class="jove_content…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta projekt finansieras av UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. och Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) och UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Vi uppskattar uppriktigt de intellektuella diskussionerna med och den tekniska supporten från Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurokirurgi), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (University of Arizona), och supportteam av Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kodon och Jon Ekman). Vi är djupt tacksamma för det effektiva stödet från alla medlemmar i Tangs, Yamaguchis, Sharmas, Au: s, Siemanns och Guans forskningslaboratorier och alla anställda på UF MAE-avdelningen.

Materials

0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in ‘omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -. F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Tags

3D Magnetic Force ActuatorMulti-functional Fluorescence ImagingNucleus MechanobiologyMagnetic MicrobeadsCell InternalizationConfocal Fluorescence ImagingLive-cell ImagingNuclear StainYES-associated Protein (YAP)Cell BoundaryCytoskeletonOptical TweezersCell FunctionsHigh Throughput
check_url/kr/64098?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image