Die Peel-Blot-Technik: Eine Kryo-EM-Probenvorbereitungsmethode zur Trennung einzelner Schichten von mehrschichtigen oder konzentrierten biologischen Proben
Summary
Die Peel-Blot-Technik ist eine Kryo-EM-Gittervorbereitungsmethode, die die Trennung von mehrschichtigen und konzentrierten biologischen Proben in einzelne Schichten ermöglicht, um die Dicke zu reduzieren, die Probenkonzentration zu erhöhen und die Bildverarbeitung zu erleichtern.
Abstract
Die Peel-Blot-Kryo-EM-Gittervorbereitungstechnik ist eine deutlich modifizierte Rückinjektionsmethode mit dem Ziel, eine Reduzierung der Schichten von mehrschichtigen Proben zu erreichen. Diese Entfernung von Schichten vor dem Einfrieren kann dazu beitragen, die Probendicke auf ein Niveau zu reduzieren, das für die Kryo-EM-Datenerfassung geeignet ist, die Probenebenheit zu verbessern und die Bildverarbeitung zu erleichtern. Die Peel-Blot-Technik ermöglicht die Trennung von mehrschichtigen Membranen in einzelne Schichten, von geschichteten 2D-Kristallen in einzelne Kristalle und von gestapelten, blattartigen Strukturen löslicher Proteine, die ebenfalls in einzelne Schichten getrennt werden können. Die hohe Probendicke dieser Probentypen stellt häufig unüberwindliche Probleme für die Kryo-EM-Datenerfassung und Kryo-EM-Bildverarbeitung dar, insbesondere wenn der Mikroskoptisch für die Datenerfassung geneigt werden muss. Darüber hinaus können Gitter mit hohen Konzentrationen jeder dieser Proben für eine effiziente Datenerfassung vorbereitet werden, da die Probenkonzentration vor der Gittervorbereitung erhöht und die Peel-Blot-Technik angepasst werden kann, um eine dichte Verteilung der einschichtigen Probe zu erreichen.
Introduction
Die Peel-Blot-Technik wurde entwickelt, um gestapelte zweidimensionale Kristalle von Membranproteinen in einzelne Schichten zu trennen, um entsprechend dünne Proben für die Kryo-EM 2D- und 3D-Datenerfassung zu erhalten und die Bildverarbeitung zu erleichtern1. Das Protokoll eignet sich in ähnlicher Weise für andere Arten von mehrschaligen Proben sowie zum Erreichen hoher Probenkonzentrationen beider Probentypen auf dem Gitter, ohne die Dicke in Z zu erhöhen.
Die Reduktion der Probenschichten auf eine Schicht wird durch die Anwendung einer Kombination aus Kapillardruck und Scherkräften in einem Protokoll erreicht, das die Rückinjektionsmethode2 wesentlich erweitert und modifiziert. Ein erster Löschschritt führt zu einem dichten Sandwiching und einer Haftung auf dem Kohlenstofffilm und einem Gitterstab auf beiden Seiten der mehrschichtigen Probe während des Blottings auf Submikron anstelle der Porengröße von 20-25 μm Filterpapier bei der Rückinjektionsmethode. Die Trennung oder das Ablösen einer einzelnen Schicht erfolgt, wenn die Trennung der Sandwichschichten erzwungen wird, sobald das Gitter vertikal auf einen Trehalose-Tropfen gedrückt wird, wodurch der Kohlenstofffilm vom Gitterstab weggedrückt wird (Abbildung 1). Die Neupositionierung der Kohlenstofffolie weg von der ursprünglichen Kontaktstelle mit der Gitterstange erfolgt im nächsten Schritt, wenn das Gitter erneut auf Submikron-Filterpapier abgetupft wird. Die Anzahl der Iterationen dieser Schritte kann für bestimmte Proben optimiert werden. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um die Probenkonzentrationen zu erhöhen und gleichzeitig eine Aggregation in Z zu vermeiden. Aufgrund der Abhängigkeit von der Haftung an Gitterstab und Kohlenstofffilm sowie der kraftvollen Trennung ist dieser Ansatz möglicherweise nicht für hochzerbrechliche Moleküle wie bestimmte empfindliche und/oder instabile Proteine und Proteinkomplexe geeignet.
Die Peel-Blot-Technik erfordert weder spezielle Ausrüstung noch teure Vorräte. Die Anwendbarkeit auf bestimmte Proben erfordert jedoch eine sorgfältige Berücksichtigung biologischer Parameter. Die Entscheidung ist für 2D-Kristalle einfacher, da Kohlenstofffilm erforderlich ist, um die Ebenheit zu gewährleisten, aber die Manipulation über die Peel-Blot-Technik kann die biologische Integrität der Probe oder die kristalline Ordnung beeinträchtigen. Die Eignung der Peel-Blot-Technik für einzelne Partikel ist auf diejenigen beschränkt und kann für diejenigen getestet werden, die Kohlenstofffilm benötigen und stabil gegen Manipulation sind. Proben mit kritischen biologischen Wechselwirkungen zwischen Schichten sind aufgrund der Störung solcher Wechselwirkungen möglicherweise nicht für die Charakterisierung mit Hilfe der Peel-Blot-Technik geeignet.
Die Peel-Blot-Technik (“Peel-Blot”) wird am schnellsten durch Testen und Screening mit negativen Flecken oder ungefärbten Proben durch TEM bei Raumtemperatur optimiert. Sobald die optimale Anzahl von Peel-Blot-Iterationen identifiziert wurde, kann die Zeit bis zur Kontrolle der Dicke vor der Vitrifikation bestimmt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Peel-Blot ist eine leistungsstarke Methode, um das Stapeln und die Dicke von mehrschichtigen 2D-Kristallen und ähnlichen Proben für die Kryo-EM-Datenerfassung und Bildverarbeitung zu überwinden. Eine Entscheidung über die Verwendung des Peel-Blots basiert auf biologischen Parametern der Probe und muss ebenfalls bewertet werden, sobald ein 3D-Kryo-EM-Modell verfügbar ist. Die biologische Bedeutung von Kontakten und die potenzielle Flexibilität von Kontaktregionen werden bei dieser Bewertung besonders wichtig sei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ein Teil dieser Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss HL090630 (ISK) unterstützt.
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
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