Her leveres en optimeret trin-for-trin protokol til fiksering, immunostaining og sektionering af embryoner for at detektere specialiseret signalfilopodia kaldet cytonomer i udvikling af musevæv.
Udviklingsvævsmønster og postdevelopmental vævshomeostase afhænger af kontrolleret levering af cellulære signaler kaldet morfogener. Morfogener virker på en koncentrations- og tidsafhængig måde for at specificere forskellige transkriptionsprogrammer, der instruerer og forstærker celle skæbne. En mekanisme, hvormed passende morfogensignaleringstærskler sikres, er gennem levering af signalproteinerne af specialiserede filopodier kaldet cytonomer. Cytonomer er meget tynde (≤200 nm i diameter) og kan vokse til længder på flere hundrede mikron, hvilket gør deres bevarelse til fast billedanalyse udfordrende. Dette papir beskriver en raffineret metode til delikat håndtering af museembryoner til fiksering, immunostaining og tyk sektionering for at muliggøre visualisering af cytonomer ved hjælp af standard konfokal mikroskopi. Denne protokol er med succes blevet brugt til at visualisere cytonomer, der forbinder forskellige cellulære signalrum under musens neuralrørsudvikling. Teknikken kan også tilpasses til at detektere cytonomer på tværs af vævstyper for at lette forhør af udviklingssignalering ved hidtil uset opløsning.
Embryonal udvikling er orkestreret gennem koordineret aktivering af morfogensignaleringsveje. Morfogener er små, udskillede proteiner, der er kategoriseret i Sonic Hedgehog (SHH), transformerende vækstfaktor β (TGF-β) / knoglemorfogen protein (BMP), Wingless-relateret integrationssted (WNT) og fibroblast og epidermal vækstfaktor (FGF / EGF) familier. Morfogener produceres og frigives fra cellulære organiseringscentre under vævsudvikling og etablerer signalgradienter på tværs af organiserende cellefelter for at informere vævsmorfogenese 1,2,3,4,5. En repræsentation af morfogengradienter findes i det udviklende nervesystem, hvor det formodede centralnervesystem er mønstret gennem aktivering af morfogenvejen. Dette væv, kaldet neuralrøret, består af modsatte gradienter af SHH udskilt af den ventrale notokord og gulvplade og WNT’er / BMP’er udskilt fra dorsal tagpladen for at mønstre forskellige neurale stamfaderområder6. Neuralrøret er almindeligt anvendt til at forhøre morfogen gradient integritet i udviklingsforskning.
Morphogen gradientdannelse er afhængig af stram regulering af signaldispersion7. En cellulær mekanisme, hvormed dette sker, er gennem dannelsen af lang signalfilopodia kaldet cytonomer, der letter direkte levering af morfogener fra signalproducerende celler til specifikke målcellepopulationer. Cytonomer er blevet observeret at strække hundredvis af mikrometer til deponering af morfogener på signalmodtagende cellemembraner 8,9. Forstyrrelse af cytonemmedieret morfogentransport fører til udviklingsmæssige anomalier hos både fluer og hvirveldyr, hvilket fremhæver deres betydning under vævsmønster 10,11,12,13,14.
Til dato er cytonomer blevet dokumenteret i Drosophila-, kylling- og zebrafiskmodeller, men billeddannelse af strukturerne i udviklingen af pattedyrembryoner er fortsat udfordrende 8,9,15. En hindring for effektiv billeddannelse af cytonomer i komplekse pattedyrvæv in situ er deres tynde og skrøbelige natur, hvilket gør dem modtagelige for skader ved konventionelle fikseringsmetoder8. Vi havde tidligere udviklet og optimeret protokoller til et modificeret elektronmikroskopifikseringsmiddel (MEM-fix) for at bevare cytonomer i dyrkede celler og muliggøre deres undersøgelse ved hjælp af konfokal mikroskopi16,17.
Anvendelse af MEM-fix-teknikken har gjort det muligt at identificere nogle af de molekyler, der er involveret i SHH-induceret cytonemdannelse og funktion 11,16,17. Bekræftelse af disse fund i den fysiologisk relevante sammenhæng med neuralrørsmønster nødvendiggjorde imidlertid udviklingen af nye teknikker til at fiksere og afbilde museembryonvæv. En protokol til fastsættelse af museembryoner på en måde, der opretholder cytonemintegritet og tillader immunostaining og efterfølgende sektionering af embryonalt væv til konfokal analyse, er skitseret her. Denne protokol blev udviklet ved hjælp af et membranbundet grønt fluorescerende protein (GFP) til at mærke membranforlængelser fra de SHH-producerende celler i det udviklende neuralrør. Implementering af denne protokol vil behandle ubesvarede spørgsmål vedrørende forekomsten og betydningen af cytonemer i udviklingen af pattedyrsystemer.
Denne protokol blev udviklet til bevarelse af sarte cytonomer i embryonale vævssektioner til fluorescensmikroskopi med høj opløsning. Til dato har visualisering af cytonomer i væv på tværs af forskellige modelorganismer i vid udstrækning været afhængig af ektopisk ekspression af fluorescerende mærkede proteiner ved hjælp af levende vævsbilleddannelse. Desværre er brugen af fluorescerende mærket levende billeddannelse sjældent befordrende for analysen af endogent udtrykte proteiner, kan indføre tidsbegrænsninger og kræver specialiserede billeddannelsesstadier og mikroskoper. Farvnings- og sektioneringsmetoden, der er beskrevet her, bevarer cytonomer og andre cellulære udvidelser for at muliggøre immunohistokemi til eventuel påvisning af endogent udtrykte proteiner. Denne teknologi vil lette ny indsigt i, hvordan morfogener transporteres på tværs af forskellige væv in vivo og udvider omfanget af modelsystemer, hvor cytonomer kan studeres.
Denne protokol bruger helmonteret farvning og vibratom tyksektion, hvilket undgår brugen af ligevægtsopløsning såsom glycerol eller kryobeskyttende opløsninger såsom saccharose. Det sigter mod at minimere sektionsopdelt vævshåndtering for at muliggøre maksimal bevarelse af cellulære udvidelser. Reduceret håndtering af vævet efter sektionering gav konsekvent bedre resultater i den samlede bevarelse af cytonomer. Sektionering af embryoet er således et af de sidste trin inden billeddannelse.
MEM-fix, en fikseringsteknik udviklet til konservering af cytonomer af dyrkede celler, består af en kombination af glutaraldehyd og PFA, der muliggør forbedret 3D-bevarelse af den medfødte cellearkitektur, der kan sammenlignes med deres levende dimensioner16,17. Desværre var MEM-fix ikke nyttigt til embryofiksering, fordi glutaraldehyd kan autofluoresere og alvorligt begrænser antistofindtrængning og epitopbinding i celler på grund af høj protein tværbindingsaktivitet22,23. Således blev sektioneringsprotokoller efter PFA-fikseringsbetingelser optimeret for at muliggøre bevarelse af cellulære forlængelser i embryonalt væv. Selvom PFA kan bevare cytonemlignende forlængelser i embryonalt væv, bør billedanalyse udføres med forsigtighed. PFA kan forårsage delvis dehydrering af individuelle celler og væv, hvilket fører til mindre volumenreduktion og dannelse af små ekstracellulære rum i det faste væv.
Denne protokol undgår de ekstra trin i saccharosegenmætning til kryobeskyttelse og vævsclearvning, fordi saccharose- eller glycerolopløsninger kan forårsage en mindre genmætning af vævet24. Den resulterende mindre hævelse kan ødelægge faste cellulære forlængelser og cytonomer, der migrerer mellem celler og på tværs af væv. Dette var tydeligt, når man sammenlignede tyksnittet vibratom med kryostatsektioner. Selvom stigende vævstykkelse forbedrede bevarelsen af intakte cytonomer, havde de saccharose-resaturerede kryostatsektioner konsekvent en lavere forekomst af påviselige cytonomer.
Optimering af denne protokol afslørede, at 100 μm tykke sektioner var de bedste til at sikre bevarelse af intakte cytonemer. Tyndere sektioner bruges typisk til billeddannelse, fordi de fleste konfokale mikroskoper kun er i stand til billeddannelse med tilstrækkelig opløsning til at visualisere cellulære udvidelser til en dybde på ~ 20-40 μm uden at rydde25. Imidlertid ødelægger de mekaniske kræfter og forvrængning, der påføres embryonale celler fra bladet, mens de skæres tynde sektioner, cytonomer. Tykkere sektioner giver mulighed for et større dybdeområde inden for sektionen, samtidig med at intakte forlængelser i vævet bevares. Derudover giver brugen af tykkere sektioner mulighed for nem håndtering for at forhindre overdreven foldning eller buckling af vævssektionerne.
Denne protokol blev optimeret til maksimal bevarelse af cytonomer i væv af E8-10,5 museembryoner. Minimal manipulation af vævet efter sektionering gav konsekvent forbedret samlet bevarelse af cytonemer. Det er sandsynligt, at yderligere optimering vil være nødvendig for at tilpasse teknikken til senere udviklingsstadier og voksenvævssektioner på grund af øget størrelse og vævskompleksitet. Dette vil kræve sektionering efterfulgt af immunfluorescensfarvning. Sådant væv kan kræve yderligere rydningstrin og tilpasning af vævshåndtering under sektionering for at bevare cytonemlignende forlængelser. Disse yderligere trin skal overvejes og behandles i forbindelse med fremtidige anvendelser af denne protokol.
The authors have nothing to disclose.
Billeder blev erhvervet ved hjælp af mikroskoper vedligeholdt af Cell and Molecular Biology Imaging Core på St. Jude Children’s Research Hospital. Musestammer blev opnået fra JAX. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health grant R35GM122546 (SKO) og af ALSAC fra St. Jude Children’s Research Hospital.
12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
Super Glue | Gorilla | ||
SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |