Den nuværende protokol beskriver en rydningsteknik for risskud, som er vanskelige at forberede til interne strukturelle observationer på grund af vævets hårde, tykke eller lagdelte natur. Denne metode letter kontinuerlige og dybe fluorescensobservationer, selv hos voksne risplanter.
Den nyligt udviklede rydningsteknologi, der eliminerer brydningsindeksmismatch og mindsker auto fluorescerende materiale, har gjort det muligt at observere plantevæv i tre dimensioner (3D), samtidig med at deres indre strukturer bevares. I ris (Oryza sativa L.), en monocot model plante og en globalt vigtig afgrøde, er clearing teknologi blevet rapporteret i organer, der er relativt lette at observere, såsom rødder og blade. Anvendelser af clearingteknologi i skyde apikal meristem (SAM) og stilke er også blevet rapporteret, men kun i begrænset omfang på grund af den dårlige penetration af clearingopløsningen (CS) i disse væv. Den begrænsede effektivitet af clearingopløsningerne i disse væv er blevet tilskrevet autofluorescens, fortykkelse og hærdning af vævene i stammen, da de vaskulære bundter og epidermis udvikler sig og lagdeler SAM med vandafvisende blade. Den nuværende protokol rapporterer optimering af en clearing tilgang til kontinuerlig og 3D observation af genekspression fra SAM / ung panik til bunden af skuddene under udvikling. Faste vævsprøver, der udtrykker en fluorescerende proteinreporter, blev trimmet i sektioner ved hjælp af en vibrerende mikroskiver. Når en passende tykkelse blev opnået, blev CS påført. Ved specifikt at målrette det centrale væv steg penetrationshastigheden og ensartetheden af CS, og den tid, der kræves for at gøre vævet gennemsigtigt, faldt. Derudover muliggjorde rydning af de trimmede sektioner observation af den interne struktur af hele optagelsen fra et makroperspektiv. Denne metode har potentielle anvendelser i dyb billeddannelse af væv af andre plantearter, der er vanskelige at rydde.
Nyligt udviklet rydningsteknologi har gjort det muligt at observere planternes dybe væv og samtidig bevare deres indre struktur 1,2,3. I dicotmodelplanten Arabidopsis er der udført mange undersøgelser af fluorescerende proteinbilleddannelse ved hjælp af clearingteknologi for at eliminere brydningsindeksmismatch og fjerne auto-fluorescerende materialer 4,5,6. Selvom brugen af clearingteknologi 7,8 og 3D-billeddannelse ved cellulær opløsning9 er blevet rapporteret i ris (Oryza sativa L.), en monocot-modelplante og en globalt vigtig afgrøde, er disse begrænset til relativt tynde og bløde organer, såsom rødder, blade og skud apikal meristem (SAM), som er lette at observere.
Skuddet er det vigtigste organ, der udgør de overjordiske dele af vaskulære planter. I ris består skud af en række lodret stablede “phytomers”, der består af aksillære knopper, blade og stammen10. På spidsen af skuddet består SAM af udifferentierede stamceller i midten. Phytomers dannes ved differentiering af celler afledt af SAM. Efter at planterne skifter fra vegetativ til reproduktiv fase, forlænges risstængler, og SAM differentieres i ungepanikler 10. Denne udviklingsændring ledsages af udsving i ekspressionen af forskellige gener i stilkene og SAM/unge panikler. For at forstå de mekanismer, der ligger til grund for celledifferentiering i forskellige væv, er det vigtigt strukturelt at observere cellemorfologien og genekspressionen i interne skudvæv. Imidlertid udgør den dybe billeddannelse af stængler (knuder og internoder) i skuddet en udfordring på grund af ineffektiviteten af rydningsløsninger til at trænge ind i vævet. Stængler gennemgår straks en hurtig volumenforøgelse fra lateral vækst efter differentiering fra SAM. Hærdningen af risknudevævene på grund af fortykkelsen af de vaskulære bundter og det vandrette komplekse led af den nodale vaskulære anastomose ud over den høje afstødning af risskud bidrager alle til at begrænse penetrationen af CS istilke 10.
Denne undersøgelse havde til formål at observere ændringer i genekspression i risskudvæv ved hjælp af en strukturel dyb fluorescensteknik. Dette arbejde optimerer en clearingprotokol for ris til kontinuerligt at observere genekspression fra SAM / ung panik til basen i en 3D-struktur snarere end på en plan overflade ved hjælp af et konfokalt lasermikroskop.
Kritiske trin i protokollen
De kritiske trin i denne protokol er fiksering og trimning. Risskud har hårde, tykke eller lagdelte væv, der begrænser penetrationen af den fikserende opløsning. For at forbedre permeabiliteten af den fikserende opløsning blev den ene side af vævet tyndt barberet ved prøveudtagning, som vist i figur 1E-F. Derudover blev vakuumbehandlingerne gentaget to gange ved hjælp af højere tryk. Desuden blev prøverne fastsat natten over ved 4 °C i stedet for den sædvanlige 2 timers fiksering ved 4 °C.
Nøglepunktet i trimningstrinnet er at bestemme tykkelsen af vævene, der skal forberedes til at observere de fluorescerende proteiner, samtidig med at deres indre struktur bevares efter en kort periode med CS-behandling. Som vist i figur 2C blev de 1 mm tykke prøver, håndtrimmet så tynde som muligt, kun gennemsigtige i et begrænset antal væv, selv efter 3 måneders CS-behandling. Derfor er trimningstrinnet afgørende for dyb fluorescensobservation af voksne risskud. I denne undersøgelse blev prøverne trimmet til en tykkelse på 130 μm, som vist i figur 2D. Tykkelsen på 130 μm gjorde det muligt at rydde bladene efter 1 uges CS-behandling og hele prøven efter 2 uger. Voksne risskud ved 9-10 LS blev brugt i denne undersøgelse. Tykt, men blødere væv fra yngre risskud kan ryddes hurtigere med CS-behandlingen. Tykkelsen af prøverne og varigheden af CS-behandlingen skal justeres i henhold til vævstype, tilstand og tykkelse af den 3D-struktur, der skal observeres.
Ændringer og fejlfindingsmetoder
CS udfældes let ved lave temperaturer. Den udfældede CS kan ikke bevare de fluorescerende proteiner; derfor skal der udvises forsigtighed ved opbevaring af prøverne ved den korrekte temperatur. Derudover har både CS og fiksiv opløsning ingen antiseptisk virkning; derfor vil fluorescerende proteiner blive nedbrudt, hvis de er forurenet. Jorddyrket ris er tilbøjelig til svampevækst; Prøveudtagning og håndtering af prøver skal derfor udføres med omhu for at undgå kontaminering.
Overskydende fluorescerende farvestoffer i bufferen kan afgive baggrundsfluorescens og forstyrre mikroskopiske observationer. For eksempel blev en calcofluor hvid opløsning indeholdende Evans blå farvestof tidligere anvendt. Efter farvning i 1 time og vask i 1 time blev de fluorescerende proteiner af OsMADS15-mOrange observeret ved anvendelse af en 555 nm laser. Imidlertid kunne fluorescerende proteiner ikke observeres på grund af baggrundsfluorescensen afledt af Evans blå farvestof. Denne baggrundsfluorescens blev næsten elimineret ved at vaske prøverne i 2 timer. Desuden var de fluorescerende proteiner klarere, hvis prøverne blev efterladt natten over. Derfor blev en ren calcofluor hvid opløsning anvendt i denne undersøgelse. Baggrundsfluorescens afledt af det fluorescerende farvestof bør kontrolleres ved hjælp af forskellige laserbølgelængder før observationer.
Begrænsninger af metoden
Som vist i figur 3 blev der observeret dybe fluorescerende proteiner i prøverne, der var 130 μm tykke efter 2 ugers CS-behandling. Dette er i overensstemmelse med resultaterne vist i figur 2D, hvor den 130 μm tykke prøve blev gennemsigtig efter 2 ugers CS-behandling. Som vist i figur 3A var autofluorescens af cytoplasmaet imidlertid stadig mærkbar i knuderne efter 2 uger og blev først fuldstændigt fjernet efter 4 ugers CS-behandling. Noder har en høj celletæthed og kræver derfor længere tid at fjerne auto-fluorescerende materialer.
Som vist i figur 3C blev dybe fluorescerende proteiner observeret i bladene uden CS-behandling, men lysstyrken var svagere end i knuderne og internoderne i samme dybde på 20 μm. Efter 1 uges CS-behandling var de fluorescerende proteiner lysere. Klorofyl er rigeligt i blade og absorberer 488 nm excitationslys. De har også orange / rød autofluorescens, som kan forstyrre observationen af fluorescerende proteiner ved hjælp af en 555 nm laser. Efter 1 uges CS-behandling blev klorofyl og andre auto-fluorescerende materialer fjernet, hvilket resulterede i billeder med højt signal/støj-forhold.
De dybder, der kunne observeres i væv efter 2 uger og 4 ugers CS-behandling, var ikke signifikant forskellige, selvom de fluorescerende proteiner syntes svagere efter 4 uger (figur 3). Normalt svækkes lysstyrken af fluorescerende proteiner og autofluorescens med tiden, hvilket resulterer i et højere signal-støj-forhold. Derfor kan fluorescerende proteiner observeres tydeligere ved at justere de mikroskopiske forhold og billedbehandling. Baseret på disse resultater blev det konkluderet, at 2 ugers CS-behandling kunne lette observationen af dybe fluorescerende proteiner i betragtning af vores prøvebetingelser. Der er dog brug for 4 uger til at observere klarere billeder, der helt udelukker de auto-fluorescerende materialer.
Strukturer med stærk autofluorescens, såsom vaskulære bundter og multi-arm celler, kan ikke ryddes i CS. For at observere disse strukturer uden autofluorescens er det nødvendigt at anvende en tidsgating metode12 eller at opnå billeder ved spektroskopi af fluorescensspektret. Et to-fotonmikroskop kan være mere egnet til at observere dybere væv, hvis der observeres tykkere væv.
Metodens betydning i forhold til eksisterende og alternative metoder
Generelt er de indre strukturer af risplanter blevet observeret ved hjælp af enten kryostat eller vibratomsektion. En kryostat er velegnet til forberedelse af tynde sektioner, som giver lettere observation, men forberedelsen af prøverne og driften af udstyret er tidskrævende. Rekonstruktion af den oprindelige 3D-struktur fra tynde sektioner er også vanskelig. Vibratomet er relativt let at betjene og velegnet til fremstilling af tykke sektioner. Imidlertid tillader tykke sektioner af målvæv kun observationer af den afskårne overflade og ikke dybe væv, som lyset ikke kan nå. Af disse grunde er ingen af metoderne egnede til dybe fluorescensobservationer.
Denne undersøgelse behandlede udfordringer i dyb fluorescensobservation i risskud, såsom den begrænsede vævsindtrængning af CS og den dårlige objektopløsning under et konfokalt mikroskop ved at kombinere eksisterende metoder. Som vist i figur 4 observerede vi fluorescerende proteiner (OsMADS15-mOrange) udtrykt i de dybe væv af voksne risskud fra den unge panik til basen. Figur 4D fokuserer på blomster og viser dybe fluorescerende proteiner med 3 μm intervaller. Væv over -130 μm dybde blev observeret efter 2 ugers CS-behandling, men kun væv inden for -27 μm dybde blev observeret (data ikke vist) i buketten i samme størrelse og vækststadium uden CS-behandling. Den nuværende forbedrede protokol tillod observation ikke kun af overekspression af gener, men også naturlig genekspression i det dybe væv af voksne risskud.
Metodens betydning og potentielle anvendelse på specifikke forskningsområder
Denne protokol, som optimerer den dybe fluorescensobservation af voksne risskud, muliggør effektiv rydning af hårdt, tykt eller lagdelt væv ved at trimme unødvendigt væv og øge permeabiliteten af CS. Derudover blev tykkelsen af prøverne til analyse optimeret for at muliggøre kontinuerlig og strukturel dyb fluorescensobservation ved hjælp af et konfokalt lasermikroskop, som normalt ikke kan løse tykke eller uigennemsigtige væv.
Det er vanskeligt at sammenligne risprøver på forskellige vækststadier, fordi de fluorescerende proteiner nedbrydes over tid i fikserings- og PBS-opløsningerne. Imidlertid kan de fluorescerende proteiner i CS opbevares i mere end 5 måneder1. Den lange holdbarhed af CS er en stor fordel for dyb fluorescensobservation i ris.
For nylig er der udviklet mange clearingteknologier, der gør det muligt at observere dybe væv i 3D, samtidig med at deres interne strukturer bevares. Disse teknologier er fortsat med at udvikle sig, og nye clearingløsninger er blevet udviklet. Et godt eksempel er iTOMEI14, som muliggør effektiv klorofylfjernelse og lysere fluorescensdetektion. Et andet eksempel er ClearSeeAlpha15, som forhindrer bruning af væv under rydning af behandling og får dem til at fremstå gennemsigtige. En kombination af disse clearingløsninger med den nuværende metode kan muliggøre en mere effektiv clearing.
Det forventes, at den nuværende metode vil hjælpe med at få ny indsigt gennem dyb billeddannelse af ikke kun ris, men også andre planter.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. R. Terada, Dr. Z. Shimatani og Dr. H. Tsuji for at give os OsMADS15-mOrange frø; Dr. D. Kurihara for at give os NGCN-konstruktionen; og Dr. R. Shim for redigering af vores manuskript. Dette arbejde blev finansieret af JSPS KAKENHI (tilskudsnumre JP20H05912, 20H05778, 20H05779) og af SATREPS-programmet (nr. JPMJSA1706) fra JST og JICA.
1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |